Hvordan kontrolleres cellens nedbrydende enzymer?

Publiceret April 2012

Næsten alle enzymer er regulerede, men de enzymer, der er i stand til at nedbryde kroppens funktionelle biomolekyler, DNA, RNA og protein, må i særlig grad tøjles så de ikke forårsager unødig destruktion af livsnødvendige komponenter i cellen. Således syntetiseres eksempelvis de proteaser, der er ansvarlige for nedbrydning af proteiner i fødevejen i en inaktiv form, der først aktiveres når der er brug for enzymets aktivitet og det samme gælder blodbanens proteaser, der er ansvarlige for koagulering af blod på de rigtige tidspunkter. Under den centrale genekspressions transskriptionsproces kopieres den information, der er stabilt lagret i DNA til en midlertidig kopi i form af ribonukleinsyre (RNA) og som for proteinerne er den efterfølgende nedbrydning af disse molekyler strengt reguleret i alle organismer. Forskning i nedbrydningsenzymernes funktion og enzymologi foregår til dels in vivo direkte i cellerne og dels via biokemiske analyser og strukturelle studier udenfor cellerne, hvorved specifikke, funktionelle aspekter kan studeres i lyset af den tredimensionelle opbygning af enzymerne. I denne artikel gennemgås eksempler på RNA-nedbrydende enzymer, for hvilke vi har opnået en stor indsigt via sådanne studier.

Det klassiske billede indenfor molekylærbiologien af RNA som et mellemstadium mellem DNA og protein har på det seneste vist sig at være stærkt forsimplet. Udover informationsmolekylet messenger RNA (forkortet mRNA) findes der også stabile RNA (f.eks. ribosomalt RNA, rRNA og transfer RNA, tRNA), og tillige har man i de seneste år fundet en lang række nye klasser af diverse RNA-molekyler, der hver især er i stand til at udføre eller påvirke forskellige funktioner i cellen. Ribosomalt RNA spiller en central rolle i ribosomets struktur og i reaktionen, der leder til dannelsen af peptidbindinger; tRNA er ligeledes meget centralt for proteinsyntesen ved at specifikt overføre aminosyrer til ribosomet; små nukleære RNA (snRNA) deltager i splejsningsmekanismen, hvorved stykker af nyligt syntetiseret mRNA kobles sammen under fjernelse af ikke-kodende elementer (introns); mikro-RNA (miRNA), der regulerer proteinsyntesen ved at være binde specifikt til sekvenser i mRNA; og endelig guider små, nukleolære RNAer (snoRNAer) modningen af selve den ribosomale RNA. Alle de sidstnævnte falder ind i kategorien for ikke-kodende RNA molekyler, idet de ikke koder for protein som i det klassiske eksempel med mRNA.

2012-2 Exosomet 3D

Figur 1. Den tredimensionelle opbygning af exosomet.
Strukturen af den menneskelige exosomring set fra siden
(øverst) og ovenfra (nederst). Ringen bestående af seks
proteiner er vist med grønne cartoons, mens
"cap"-strukturen er vist med blåt. Fra Liu et al. (2006),
PDB-kode 2NN6..

Alle kendte RNA-molekyler produceres i første omgang ved transskription baseret på koden lagret i DNA, men mange typer RNA gennemgår komplicerede modningstrin (kløvning, splejsning, etc) inden de er funktionelle. I den anden ende modvejes produktionen af RNA af specifik nedbrydning af RNA, der igen reducerer koncentrationen af de enkelte molekyler og gendanner byggestene til brug i transskriptionsprocessen. Traditionelt har man haft stor fokus på hvorledes transskriptionsprocessen, splejsning etc. foregår, men i de seneste år er også nedbrydningsprocesserne blevet studeret grundigt, da det stabile RNA-niveau altid vil være en ballance mellem produktion og destruktion. Basalt set findes der tre forskellige typer af cellulære RNA-nedbrydende enzymer (også kaldet for ribonukleaser eller simpelthen RNaser): Endonukleaser der kløver RNA-strengen i midten, 5’-3’ exonukleaser, der er i stand til at nedbryde RNA fra start (5’) til slut (3’), og endelig 3’-5’ exonukleaser, der nedbryder RNA den anden vej, altså fra 3’ til 5’ enden. Mange af disse RNA-nedbrydende systemer er helt generelle og genfindes i alle levende celler, dvs. både bakterier, archaea og eukaryoter. I Ditlev Egeskov Brodersens forskningsgruppe ved Institut for Molekylærbiologi og Genetik ved Aarhus Universitet arbejder vi med at forstå hvordan specielt 3’-5´ exonukleaser foretager nedbrydningen af RNA. Et centralt 3’-5’ nedbrydende enzym i højerestående liv (eukaryoter) er exosomet, der er et multiprotein kompleks bestående af mindst 10 proteiner. En ringstruktur bestående af seks proteiner danner et indre kammer mens tre andre proteiner på toppen af ringen stabiliserer ringen og danner den såkaldte ”cap”. Den tredimensionelle struktur af exosomets 9 centrale komponenter er blev bestemt vha. røntgenkrystallografi og er vist i Figur 1. Exosomet genfindes også i simplere organismer, archaea, og herfra ved man at alle seks proteiner i ringen fungerer som aktive ribonukleaser og dermed formentlig deltager i nedbrydningsprocessen. Dette har ført til en model, hvorved adgangen til ringens centrale kammer kontrolleres af ”cap” strukturen for dermed at undgå utilsigtet nedbrydning af RNA. Overraskende har exosomringen i højerestående eukaryoter tabt sin aktivitet og står nu tilbage som en rent strukturelt skelet. Men hvis ringen er inaktiv, hvad nedbryder så RNA i højerestående liv? Det viser sig, at der i eukaryoter findes to yderligere ribonukleaser, kaldet Rrp44p og Rrp6p, der binder til exosomringens ydre overflade og man kan vise at de to tilsammen udgør hele aktiviteten af exosomet i højerestående organismer. Ved hjælp af røntgenkrystallografiske studier samt elektronmikroskopi har man vist at Rrp44p sidder i bunden af ringen, dvs. modsat ”cap”-strukturen og på den måde kan RNA 3’ ender leveres i dets ”active site” via kanalen i midten af ringen. Rrp44p indeholder både 3’-5’ og endonukleolytiske aktiviteter, dvs. at enzymet potentielt både kan nedbryde RNA fra slut til start samt i midten. Rrp6p-nukleasen har kun et 3’-5’ aktivt site og findes ydermere kun associeret med exosomet i cellekernen. Det er endnu uvist hvor Rrp6p sidder på exosomets ydre overflade, hvordan RNA 3’-ender bliver leveret og hvordan sammenspillet mellem Rrp6p og Rrp44p bliver reguleret.

2012-2 Exonuklease 3D

Figur 2. Den tredimensionelle opbygning af 3'-5'
exonukleasen Rrp6p. Den tredimensionelle
opbygning af Rrp6p fra gær. Enzymet består af
et centralt exo-domæne indeholdende det aktive
site (rødt), et RNA-bindende domæne (grønt) samt
et domæne, der binder kofaktoren Rrp47p (blåt).
Fra Midtgaard et al. (2006), PDB-kode 2HBJ.

I laboratoriet arbejder vi især på at forstå Rrp6p ribonukleasen og hvordan andre faktorer påvirker og regulerer dens aktivitet. Som et vigtigt første skridt på vejen for at forstå dette enzyms rolle i nedbrydningssystemer har vi bestemt enzymets tredimensionelle struktur og analyseret dets nedbrydningsaktivitet på specikke RNA-substrater (Figur 2). Den tredimensionelle struktur viser først og fremmest den rumlige og kemiske opbygning af det aktive site og ligeledes dets formodede reaktionsmekanisme. Den mere overordnede, tertiære struktur giver også et bud på hvordan de forskellige domæner i enzymet samarbejder i at degradere RNA. Udover at være en vigtig faktor for omsætning af RNA og dermed regulering af mængden af RNA i cellerne, har andre studier vist at Rrp6p er involveret i modning af 3’-enden af de fleste kendte typer af RNA substrater. Under denne proces foregår der en ufuldstænding nedbrydning af substrater i 3’ til 5’ retningen, hvorefter der dannes et stabilt og modent molekyle. Dette er et afgørende trin i dannelsen af mange ikke-kodende RNAer, bl.a. rRNA. Det er stadig en gåde hvordan ét og samme enzym kan deltage i både komplet 3’-5’ nedbrydning af RNA og specifik modning af 3’ ender, afhængigt af substraternes egenskaber. Den samme komplekse funktionsbillede ses for 5’-3’ nedbrydningsenzymet Rat1 der ligeledes både kan degradere eller modne RNA. Man antager at enzymerne reguleres via binding til andre faktorer der regulerer disse to processer og dermed bestemmer RNA-molekylets skæbne, dvs. hvorvidt det nedbrydes helt eller modnes. Det er dog også en mulighed at RNA-molekylet selv indeholder nogle elementer, f.eks. dobbeltstrengede områder, der foranlediger at nedbrydningsprocessen stopper på det rigtige tidspunkt. Genetiske studier vist at Rrp6p har et partnerprotein, Rrp47p, der binder til enzymet og regulerer dets aktivitet på en endnu ukendt måde. For Rrp47p har det været vist at proteinet har specificitet overfor dobbeltstrenget RNA og det kan derfor være med til at styre nedbrydningsprocessen. En hypotese går derfor i øjeblikket ud på at Rrp47p regulerer Rrp6p enzymet ved at binde og rekruttere specifikke RNA substrater og dermed facillitere levering af deres 3’ ender til det aktive site. Denne hypotese testes i øjeblikket i vores laboratorium udfra både strukturelle og funktionelle indgangsvinkeler. Bl.a. har vi benyttet røntgen småvinkelspredning (SAXS) til at bestemme opbygningen af Rrp6p-Rrp47p komplekset i grove træk. Disse resultater kombinres herefter med nedbrydningsforsøg på specifikke RNA-substrater samt gelskift-assays, der beskrive enzymets, eller kompleksets, affinitet overfor RNA. Målet med denne forskning er på lang sigt at afklare, hvorledes de RNA-nedbrydende enzymer er reguleret og hvilke andre proteiner og faktorer, der påvirker dem.

Ribonuklease

Mekanisme

Funktion

Rrp44

3’-5’ hydrolytisk og endonukleolytisk

Nedbrydning af RNA , associerer med exosomet i kernen og cytoplasma

Rrp6

3’ - 5’ hydrolytisk

Nedbrydning og modning af RNA, associerer med exosomet i kernen og binder Rrp47p

Rat1

5 ’ - 3’

Exonuklease i kernen

Xrn1

5’ - 3’

Exonuklease i cytoplasma

Faktabox: Centrale RNA nedbrydningsenzymer i højerestående organismer

Referencer

Bonneau, F., Basquin, J., Ebert, J., Lorentzen, E., and Conti, E. (2009). The yeast exosome functions as a macromolecular cage to channel RNA substrates for degradation. Cell 139, 547-559.

Liu, Q., Greimann, J.C., and Lima, C.D. (2006). Reconstitution, activities, and structure of the eukaryotic RNA exosome. Cell 127, 1223-1237.

Lorentzen, E., Basquin, J., and Conti, E. (2008a). Structural organization of the RNA-degrading exosome. Current opinion in structural biology 18, 709-713.

Lorentzen, E., Basquin, J., Tomecki, R., Dziembowski, A., and Conti, E. (2008b). Structure of the active subunit of the yeast exosome core, Rrp44: diverse modes of substrate recruitment in the RNase II nuclease family. Molecular cell 29, 717-728.

Lorentzen, E., Walter, P., Fribourg, S., Evguenieva-Hackenberg, E., Klug, G., and Conti, E. (2005). The archaeal exosome core is a hexameric ring structure with three catalytic subunits. Nature structural & molecular biology 12, 575-581.

Midtgaard, S.F., Assenholt, J., Jonstrup, A.T., Van, L.B., Jensen, T.H., and Brodersen, D.E. (2006). Structure of the nuclear exosome component Rrp6p reveals an interplay between the active site and the HRDC domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 11898-11903.