Global sekventering – nyt våben i fedmeforskning

Publiceret April 2009

High-throughput DNA-sekventering har revolutioneret genomforskningen og breder sig nu som ringe i vandet langt ind i andre forskningsområder. Global sekventering af transkriptionsfaktorers DNA-bindingssteder (ChIP-seq) giver en unik mulighed for at karakterisere reguleringen af gener og identificere større transkriptionelle netværk. Kortlægningen af samtlige PPARγ bindingssteder gennem fedtcelledifferentiering er et af de nye våben i fedmeforskningen på vejen mod bedre diabetesmedicin.

Regulering af fedme via PPAR transkriptionsfaktorer

Fedme og fedme-associerede sygdomme udgør et af vor tids største helbredsmæssige problemer. Nedsat fysisk aktivitet og øget energiindtag er kendetegn for de livsstilsændringer, der har ført til, at fedme nu er så udbredt, at WHO har erklæret fedme for en global epidemi. Behandlingen af fedme-relaterede sygdomme (f.eks. type-II-diabetes og hjerte-kar sygdomme) kræver et indgående kendskab til reguleringen af kroppens energibalance. Peroxisom proliferator-aktiverede receptorer (PPAR) er velkarakteriserede regulatorer af kroppens energiomsætning og er vigtige terapeutiske mål netop i behandlingen af fedme-relaterede sygdomme. Derfor har denne familie af transkriptionsfaktorer været undersøgt indgående. Tidligere studier, som har undersøgt de molekylære mekanismer for PPAR-medieret transkription, er blevet udført gen for gen, men udviklingen af nye high-throughput DNA-sekventerings teknologier (f.eks. Illuminas Solexa (1)), har gjort det muligt for første gang at undersøge transkriptionsfaktorers DNA-bindingssteder i hele genomet samtidigt.

Fedtcelledifferentiering og Chromatin Immunopræcipitation (ChIP) - klik for en større version
Figur 1: Fedtcelledifferentiering og Chromatin Immunopræcipitation (ChIP). (A) Differentiering af præfedtceller til modne fedtceller fra Dag 0 til Dag 6 (3T3-L1 cellelinie). (B) In vivo cross-linking fikserer protein-DNA interaktioner i levende celler. Efter sonikering (DNA fragmentering) anvendes specifikke antistoffer til at immunopræcipitation af transkriptionsfaktoren med cross-linket DNA. Herefter oprenses DNA og analyseres vha. qPCR, DNA micro-array eller high-throughput sekventering. Større udgave.

Chromatin Immunopræcipitation (ChIP) - et snap-shot af transkriptionsfaktor bindingssteder in vivo

Transkriptionsfaktorer er proteiner, som regulerer udtrykket af de gener, der er nødvendige for, at en given celle kan opretholde sin funktion. Hermed PPARγ er en transkriptionsfaktor, der er vigtig for mange cellers fedtmetabolisme. Den er nødvendig i udviklingen af selve fedtcellen og for lagring af fedt i cellen. PPARγ regulerer udtrykket af bestemte gener ved at binde til specifikke regulatoriske sekvenser i genomet (transkriptionsfaktor bindingssteder), hvorfra den rekrutterer yderligere proteiner, der medvirker til aktiveringen af de pågældende gener. Til at undersøge de molekylære interaktioner, hvor igennem PPARγ regulerer udtrykket af gener i fedtceller anvendes en teknik, der kaldes Chromatin Immunopræcipitation (ChIP). Vha. denne teknik fikserer man, i levende celler, bindingen af proteiner til de regulatoriske sekvenser i genomet via kemisk cross-linking af protein og DNA. Ved brug af antistoffer kan man efterfølgende isolere transkriptionsfaktoreren sammen med de tilhørende regulatoriske DNA sekvenser, som den er bundet til. Herefter analyseres de DNA sekvenser, hvortil transkriptionsfaktoren var bundet f.eks. vha. real-time qPCR (Figur 1). Derved får man et "snap-shot" af, i hvilket omfang transkriptionsfaktoren binder til en kendt regulatorisk sekvens under en given situation i cellen. ChIP-teknikken kan derfor danne grundlag for en forståelse af de molekylære mekanismer, hvorved f.eks PPARγ regulerer udtrykket af gener i fedtcellen. 

Global sekventering af transkriptionsfaktor bindingssteder (ChIP-seq)

Tidligere studier af PPARγ og dennes interaktion med regulatoriske sekvenser i genomet har været begrænset til et fåtal af kendte bindingssteder (2). Men udviklingen af nye high-throughput sekventeringsteknologier har muliggjort en total kortlægning af alle PPARγ bindingssteder i hele genomet. Med kombinationen af ChIP teknikken og high-troughput sekventering (ChIP-seq (1, 3, 4)) har vi i Susanne Mandrups forskningsgruppe på Syddansk Universitet kortlagt alle PPARγ bindingssteder i fedtceller fra mus (5). I dette studie identificerede vi mere end 5000 PPARγ bindingssteder gennem en fedtcelles udvikling (differentiering) fra en præ-fedtcelle til en moden fedtcelle. Denne kortlægningen af samtlige PPARγ bindingssteder i genomet giver en unik mulighed for yderligere karakterisering af enkelt geners regulering og for identificering af større PPARγ-afhængige transkriptionelle netværk.

PPARγ ChIP-seq gennem fedtcelledifferentiering. Klik for en større udgave.
Figur 2: PPARγ ChIP-seq gennem fedtcelledifferentiering. (A) PPARγ bindingssteder ved genet Pnpla2 (Patatin-like phospholipase domain-containing protein 2) kodende for den fedtcellespecifikke triglycerid lipase (Atgl). (B) PPARγ bindingssteder ved genet Agpat2 (acylglycerophosphate transferase 2) involveret i triglycerid syntese. (C) Lokalisering af PPARγ bindingssteder på Dag 6. Afstand er angivet i forhold til nærmeste gens transkriptionelle start sted. Antal bindingssites er vist i procent af total antal PPARγ bindingssteder. Exon (sort firkant), transkriptionelt start site (sort pil). Større udgave.

I modsætning til tidligere, hvor de fleste PPARγ bindingssteder blev identificeret nær det transkriptionelle start sted, har dette studie vist, at PPARγ bindingssteder ligger spredt ud over hele genomet med en stor del beliggende i introns eller langt fra det transkriptionelle start sted (Figur 2). Ydermere viser det, at det samme gen ofte bliver reguleret fra flere forskellige regulatoriske sekvenser. Denne observation tyder på, at PPARγ binding til adskillige regulatoriske sekvenser i og omkring PPARγ regulerede gener kan være nødvendig for korrekt aktivering af et givent gen. Netop samspillet mellem flere regulatoriske sekvenser førte til undersøgelsen af andre transkriptionsfaktorers binding nær PPARγ bindingssteder. Ved mere end 20% af alle PPARγ bindingssteder finder vi endvidere regulatoriske sekvenser, hvortil transkriptionsfaktoren C/EBP kan binde. C/EBP er ligesom PPARγ en helt central transkriptionsfaktor i fedtcellers differentiering og disse nye resultater indikerer samspil af hidtil ukendt omfang mellem disse to transkriptionsfaktorer i reguleringen af fedtcellens gener fra de samme regulatoriske områder på DNA.

Global sekventering af transkriptionsfaktor bindingssteder vha. ChIP-seq åbner altså muligheden for identificering af nye molekylære mekanismer for transkriptionel regulering.

RNA-polymerase ChIP-seq - direkte transkriptionsanalyse

Mens transkriptionsfaktorerne regulerer udtrykket af cellens gener varetages selve aflæsningen af generne (transkriptionen) af RNA-polymerasen. I mere end 10 år har DNA micro-arrays være den foretrukne teknik til at analysere det funktionelle output af cellens transkription, nemlig messenger RNA (mRNA). DNA micro-array analyser af mRNA niveaer afspejler dog ikke nødvendigvis den direkte regulering, hvormed transkriptionsfaktorer påvirker RNA-polymerasens transkription, idet stabiliteten af forskellige mRNA'er ofte varierer. Anvendelsen af RNA-polymerase ChIP-seq er derimod et direkte mål for bindingen af RNA-polymerasen til et givent gen. Hermed kan den direkte regulering af RNA-polymerasens aktivitet bestemmes kvantitativt under aktiv transkription (Figur 3). Ved at tælle samtlige sekventerede DNA fragmenter beliggende indenfor kendte gener har vi anvendt RNA-polymerase ChIP-seq til at identificere mere end 1600 regulerede gener gennem fedtcellers differentiering.

PPARγ og RNA-polymerase ChIP-seq gennem fedtcelledifferentiering. Klik for en større udgave.
Figur 3: PPARγ og RNA-polymerase ChIP-seq gennem fedtcelledifferentiering. (A) PPARγ bindingssteder og RNA-polymerase binding ved genet Scd1 (stearoyl-CoA desaturase 1). (B) PPARγ bindingssteder og RNA-polymerase binding ved genet Acsl1 (Acyl-CoA synthetase long-chain 1). Større udgave

Grupperingen af disse hhv. op- og nedregulerede gener i 5 forskellige grupper (clusters), viste sig at indeholde forskellige funktionelt relaterede kategorier af gener (Figur 4). I overenstemmelse med en fedtcelles behov for at dele sig tidligt under fedtcelleudviklingen er f.eks. cellecyklus gener transkriberet tidligt i differentieringsprocessen og efterfølgende nedreguleret. I modsætning hertil transkriber RNA-polymerasen i stigende grad gener involveret i lipid- og glukose-metabolisme frem mod etableringen af de modne fedtceller. RNA-polymerasens binding til DNA under aktiv transkription bestemt direkte ved ChIP-seq er derfor et nyt spændende alternativ til DNA micro-array analyser. Transkriptionsanalyser ved RNA-polymerase ChIP-seq er endvidere ikke begrænset til undersøgelsen af kendte gener, men muliggør også identifikation af tidligere ukarakteriserede gener, cellespecifikke transkriptionsstartsites af kendte gener, og non-coding RNA transkripter.

2009_2 RNielsen-4sm
Figur 4: RNA-polymerase ChIP-seq - regulerede gener under fedtcelledifferentiering. Gruppering af op- og nedregulerede gener i 5 forskellige grupper (cluster A-E) beregnet ved RNA-polymerasens binding til kendte gener. RNA-polymerase binding er afbilledet som Log2 ratio fra hver dag gennem fedtcelledifferentieringen relativt til dag 0. Gen ontologi (GO) analyse (DAVID) identificerede forskellige funktionelt relaterede kategorier af gener i cluster A-E. PPARγ bindingssteder er associeret til hhv. 74% og 47% af de opregulerede gener i cluster D og E. Større udgave.

Fedtcellens genomiske landskab - PPARγ vs. RNA-polymerase ChIP-seq

Kortlægningen af PPARγ og RNA-polymerasens binding i fedtcellens genomiske landskab har åbnet helt nye muligheder for at udvide kendskabet til PPARγ's regulering af gener. Undersøgelsen af de 1600 gener, som er reguleret igennem fedtcelledifferentiering, sammenholdt med lokaliseringen af PPARγ's bindingssteder, tyder på, at PPARγ regulerer langt flere gener i fedtceller end tidligere antaget. Vi finder PPARγ bindingssteder associeret til hhv. 74% og 47% af de opregulerede gener i cluster D og E, mens dette kun et tilfældet for meget få af de nedregulerede gener (Figur 4). Udover reguleringen af gener involveret i fedtcellens primære funktion, oplagring af fedt, finder vi overraskende også PPARγ associeret til gener, der styrer omsætningen af glukose og aminosyrer (Figur 5). Fremtidige forsøg vil vise, i hvilket omfang PPARγ er nødvendig for opretholdelsen af disse funktioner i fedtceller.

Global sekventering - nyt våben i fedmeforskning

Anvendelsen af high-throughput DNA-sekventering, har for første gang muliggjort undersøgelsen af transkriptionsfaktorers DNA-bindingssteder i hele genomet vha. ChIP-seq. Opdagelsen af pathways i fedtcellen, hvor PPARγ sandsynligvis regulerer et betydeligt større antal gener end hidtil antaget, vil i fremtiden danne grundlag for yderligere forståelse af PPARγ's transkriptionelle aktivitet. Dette er specielt interessant i forhold til fedmeforskningen, da de kunstige PPARγ aktivatorer, der bruges i klinikken i dag til behandling af type II diabetes, har en lang række bivirkninger. En øget forståelse af, hvordan PPARγ basalt set regulerer udtrykket af gener i fedtceller kan derfor bidrage til design af bedre og mere målrettet medicin til behandlingen af fedme og fedme-relaterede sygdomme med færre bivirkninger.

2009_2 RNielsen-5sm
Figur 5: PPARγ bindingssteder associeret med gener i fedtcellers lipid og glucose metabolisme. Gener med associerede PPARγ bindingssteder (grøn). (D) =gen i cluster D, (E) = gen i cluster E (Figur 4). (*) Gener med tidligere karakteriseret PPARγ bindingssted. (LD) Lipid dråbe. (TCA) tricarboxylsyre cyklus. Større udgave.

Referencer

A. Barski, S. Cuddapah, K. Cui, T. Roh, D. Schones, Z. Wang, G. Wei, I. Chepelev, K. Zhao, High-Resolution Profiling of Histone Methylations in the Human Genome

Cell, Volume 129, Issue 4, 823-837

Ronni Nielsen*, Lars Grøntved*, Hendrik G. Stunnenberg and Susanne Mandrup Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Subtype- and Cell-Type-Specific Activation of Genomic Target Genes upon Adenoviral Transgene Delivery, Mol Cell Biol. 2006 August; 26(15) p.5698-5714

Dustin E. Schones and Keji Zhao, Genome-wide approaches to studying chromatin modifications, Nature Reviews Genetics 9, 179-191 2008

David S. Johnson, Ali Mortazavi, Richard M. Myers & Barbara Wold, Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions, Science 316, 1497 (2007)

Ronni Nielsen*, Thomas Åskov Pedersen*, Dik Hagenbeek*, Panagiotis Moulos, Rasmus Siersbæk, Eva Megens, Sergei Denissov, Michael Børgesen, Kees-Jan Francoijs, Susanne Mandrup and Hendrik G. Stunnenberg, Genome-wide profiling of PPARγ:RXR and RNA polymerase II occupancy reveals temporal activation of distinct metabolic pathways and changes in RXR dimer composition during adipogenesis, Genes Dev. 2008 22: 2953-2967