Anvendelse af Proteomteknologi i husdyrforskningen

Publiceret Oktober 2006

Molekylære markører er vigtige redskaber i optimering af produktionsformer og produktkvalitet i landbruget. I produktion af husdyr er det især biomarkører for sundhedsegenskaber og produktkvalitet, der har stor værdi. Proteomteknologi er i dag meget anvendt i jagten på molekylære markører, og ved Danmarks JordbrugsForskning har store teknologiske investeringer og en lang række projekter i de seneste år sat skub i jagten på molekylære markører også i husdyr. Denne artikel giver et indblik i nogle teknologier og igangværende projekter på området.

Behovet for molekylære markører i husdyrproduktionen

Set med internationale øjne er dansk landbrug meget langt fremme i anvendelsen af moderne produktionsformer. Dette indebærer, at husdyrenes produktionsegenskaber (fx mælkeydelse, tilvækst, foderudnyttelse) igennem de seneste årtier stadigt er blevet optimeret, men også at stadigt mere intensive produktionsformer og større dyreenheder er almindelige. Samtidig skaber ændringer i produktionsformerne nye udfordringer, hvor løsningerne kræver udvikling af ny biologisk viden. Jagten på biomarkører for vigtige produktions- og sundhedsegenskaber hos husdyr er et forskningsområde, der har stort potentiale for at løfte nogle af de udfordringer, en industrialiseret husdyrproduktion står overfor.

Information om husdyrenes genomsekvens, der for kvægs vedkommende allerede er tilgængelig, og for svin forventes afsluttet i 2007, er også medvirkende til, at jagten på biomarkører i svin og kvæg nu kan gennemføres på lige fod med tilsvarende projekter i mennesket og i klassiske modelorganismer som mus, rotter og gær. Derfor er der også i husdyrforskningen sat fokus på at beskrive genernes funktion ved hjælp af integration af post-genome teknologier, hvilket omfatter proteomics, transkriptomics, og metabolomics, ofte omtalt som ”omics” teknologier.

En række igangværende projekter har til formål at beskrive proteinbaserede biomarkører for sundheds- og produktionsegenskaber, genetisk variation og tidlig diagnostik af sygdomme i svin og kvæg. Denne artikel beskriver aktuelle eksempler på anvendelsen af proteomteknologi i jagten på biomarkører i svin og kvæg.

Teknologiplatforme til husdyr-proteomics

Proteomanalyse har som mål at beskrive ændringer og mønstre i cellers proteinekspression, ofte med henblik på at finde proteinbaserede biomarkører, der beskriver et sygdomsforløb eller kan bruges til diagnostik. De proteomteknologier og tilgangsvinkler, der bruges i jagten på biomarkører i husdyr, svarer i store træk til teknologier, der er velkendte fra anden biomedicinsk forskning, og er i dag baseret på automatiseret proteinkarakterisering igennem et samspil af elektroforeseteknologi, HPLC og massespektrometri (MS).

På et vigtigt punkt adskiller husdyr-proteomics sig væsentligt fra human-medicinsk proteomics, nemlig i tilgangen til vævsmateriale. Hvor det i medicinsk forskning tit er tilgangen til informative prøver, der begrænser projektets målestok, er dette sjældent tilfældet i husdyrforskningen.  For eksempel kan vi gennemføre et meget stort screeningsprojekt for tidlige diagnostiske markører for yverbetændelse hos kvæg ved at inddrage mælkeprøver, der er indsamlet fra flere tusinde dyr, og hvor indgående kendskab til dyrenes genetik, fodring, og sygdomsforløb ligger til grund for markøranalyserne. Desuden er det muligt at indsamle mælke- og vævsprøver på optimal og ensartet vis. Dette gør det muligt at anvende storskala teknologier, hvor kvantificeringsprincipperne er baseret på, at observationerne er udført i et meget stort dyremateriale, og at den tekniske variation er meget lille.

Ved Danmarks JordbrugsForskning analyserer vi komplekse proteomprofiler hovedsageligt igennem samspillet af to meget forskellige massespektrometri-platforme, der er beskrevet i Figur 1.

Teknologiplatforme i proteomanalyse
Figur 1. Teknologiplatforme i proteomanalyse: Et samspil af to meget forskellige teknologi platforme bruges i biomarkør analysen. Til storskala screening bruges robot-baseret prøve forberedelse og MALDI-TOF baseret protein/peptid fingerprint analyse. I en stor-skala analyse kan man nemt gennemføre 1000 analyser per uge. I projekter hvor sekvensinformation og kvantitativ sammenligning er af væsentlig interesse bruges HPLC-baseret protein og peptid separation efterfulgt af ESI-MS/MS analyse. I en høj resolution screening kan vi i løbet af en uge typisk analysere fire vævsprøver, og fra disse identificere og sammenligne 1000 proteiners ekspressionsprofil.

MALDI-TOF-baseret storskala platform bruges hovedsageligt til at beskrive peptidmønstre (peptidfingerprinting). Denne teknologi er meget hurtig, og da prøveforberedelsen også i vid udstrækning er robot-baseret, er det muligt at analysere peptidmønstre fra ca. 1000 dyr i løbet af en uge. Biomarkøranalyse ved hjælp af MALDI-TOF er derfor baseret på analyser af meget store populationer af dyr, men er ikke optimal til identifikation og kvantificering af de enkelte proteiner i komplekse prøver, som væv og celler fra dyr typisk er. Arbejdsgangen i et MALDI-TOF-baseret storskala projekt er beskrevet i Figur 2.

Arbejdsgangen i en stor-skala proteom screening for tidlige markører for yver betændelse
Figur 2. Arbejdsgangen i en stor-skala proteom screening for tidlige markører for yver betændelse: Mælkeprøver indsamles fra meget store populationer af dyr (ca.100 dyr dagligt). Prøverne kommer fra både raske dyr, og fra dyr med varierende stadier af betændelse i yveret. Prøverne klassificeres i henhold til klinisk-kemisk diagnostik. Ved hjælp af robot-baseret fraktionering og prøveforberedelse kan et meget stort antal prøver undersøges (ca 1000 prøver hver uge) og en automatisering af MALDI-TOF instrumentet gør det muligt at analysere tusinder af fingerprint-spektre der danner grundlaget for en robust statistisk analyse af ændrede peptid-mønstre hos henholdsvis syge og raske dyr.

LC-LC-MS/MS-baseret højresolutions platform bruges derimod hovedsageligt til at beskrive og kvantificere de enkelte proteiner i komplekse vævsprøver. Prøveforberedelsen fra væv og celler er baseret på gentagne HPLC-separationer (LC-LC) af vævets proteiner, efterfulgt af serier med automatiseret tandem massespektrometri (MS/MS).  I løbet af en uge er det muligt at sammenligne væv fra ca. fire dyr og dermed beskrive ændrede ekspressionsmønstre og sekvensvariation i ca. 1000 proteiner fra vævsprøverne. Derfor bruges denne teknologiplatform oftest i projekter, hvor informationen om molekylære mekanismer er af væsentlig interesse, som fx i beskrivelsen af genetisk variations indflydelse på dyrets fysiologi, eller i et sygdomsforløb, hvor ny viden om molekylære mekanismer vil kunne bruges til bedre og tidligere diagnostik. 

Mange biomarkøranalyser tager udgangspunkt i en sammenlignende kvantitativ proteomanalyse. For at opnå et kvantitativt mål for proteiners ekspressionsprofil, anvendes N-terminal opmærkning af proteinernes peptider (en iTRAQ-mærkning), der er unik for hvert enkelt dyr i en sammenligning. Denne teknologi tillader, at op til fire individuelle proteomer kan kombineres og analyseres sammen, hvilket reducerer den tekniske variation imellem prøverne meget. Arbejdsgangen i en typisk komparativ LC-LC-MS/MS analyse er vist i Figur 3.

Arbejdsgangen i en kvantitativ proteom screening for ændringer i tarm epitelet hos pattegrise
Figur 3. Arbejdsgangen i en kvantitativ proteom screening for ændringer i tarm epitelet hos pattegrise: Vævsprøver udtages fra tarmepitelet fra dyr der enten har E.Coli kolonisering, eller en steril mave-tarm kanal. Proteinerne ekstraheres og klippes med trypsin, således at peptid masserne bliver optimale for ESI-MS/MS analyse. Peptider mærkes N-terminalt (hver prøve med sin unikke mærkning), og de fire proteomer kombineres. Efterfølgende analyser foretages fra denne 4-plex prøve. Gentagne serier af HPLC-fraktionering efterfulgt af serier med skiftevis MS og MS/MS analyser i et quadrupol-TOF masse spektrometer giver både sekvens information og et mål for relativ protein ekspression af de enkelte proteiner i de enkelte dyr. Hermed opnår vi information om hvilke molekylære mekanismer der er involveret i tarmepitelets samspil med bakteriekolonien.

Proteomanalyser af tarmsundhed i svin

Infektioner er et væsentligt problem i industriel husdyrproduktion. I svineproduktionen er det især infektioner i luftvejene, og mave-tarm kanalen, der ligger til grund for en meget stor del af landbrugets antibiotikaforbrug, og en forbedret tarmsundhed hos pattegrise er grundlæggende for at kunne begrænse antibiotikaforbruget i svineproduktionen. Et stort tværfagligt forskerhold har igennem de seneste fem år sat fokus på at beskrive molekylære mekanismer, der har betydning for tarm-epitelets udvikling i pattegrise. Ved hjælp af sammenlignende proteomanalyser har vi beskrevet nogle af tarm-epitelets mekanismer til optagelse af immunoglobuliner (Ig) og fundet, at skader på tarm-epitelet hos nyfødte grise indebærer, at dyret mister evnen til at optage de livsvigtige immunoglobuliner fra soens råmælk (Danielsen et al., 2006). Videre studier har nu som mål at finde de involverede Ig receptorer. Dette gennemføres ved hjælp af specifik oprensning af membranfraktioner fra pattegrisens tarm-epitel, hvorefter LC-MS/MS bruges til specifikt at beskrive, hvilke membranproteiner der er til stede i de enkelte dyr.

Patogene såvel som gavnlige mikroorganismer i den nyfødtes tarm har også stor betydning for tarm-epitelets udvikling, og vi har nu adgang til en lang række infektionsmodeller, hvor nyfødte grises tarme koloniseres med kontrollerede bakteriestammer (gnotobiotiske dyremodeller). Ved hjælp af proteom- og microarray-teknologier foretages nu en detaljeret beskrivelse af ændringerne i tarm-epitelet som følge af forskellige bakteriestammers tilstedeværelse. Til disse studier bruges iTRAQ-baseret kvantificering af proteomer, således at ikke kun de ændrede proteiner, men også de stabilt udtrykte proteiner, bliver identificeret og kvantificeret ved hjælp af meget detaljerede MS og MS/MS analyser. Figur 3 viser arbejdsgangen i hvorledes molekylære markører relateres til infektionsmodellerne. Disse studier er med til at skabe ny viden om molekylære mekanismer i pattegrisens tarmudvikling, og vil på sigt være med til at reducere infektionsproblemer i svineproduktionen.

Kødkvalitet, et komplekst biologisk problem

Kvaliteten af det kød, vi køber i supermarkedet, er et resultat af et komplekst samspil imellem produktionsvilkår, dyrets genetik og slagteriernes procesteknologi, hvilket gør, at slagterierne har meget svært ved at måle og klassificere kvaliteten på alt det kød, der processeres og sælges. Nogle vigtige kødkvalitetsegenskaber er dyrets muskeltilvækst, kødets smag, mørhed, vandbindingsevne og fedtprocent. Det er klart, at variation i en lang række gener ligger til grund for variationer i kødkvalitet, men også en række enkeltgener med meget stor effekt på veldefinerede kødkvalitetsegenskaber er i dag kendte. Studier af dyr, der bærer variation i disse enkeltgener, er derfor særligt informative i jagten på relevante biomarkører for kødkvalitet.  Proteomstudier af disse dyrs muskelmetabolisme har igennem flere år været en været en oplagt indgangsvinkel, eksempelvis hos Hedegård et al. (2004), der igennem sammenlignende proteomanalyse viser, hvorledes balancen i cellulær respiration er ændret i muskelen hos svin, der bærer en mutation i AMPK-genet.

For kødindustrien er kendskabet til og optimering af kødets mørhedsgrad af meget stor kommerciel interesse, og markører, der kan forudsige, hvorledes mørheden udvikles i kødet under modning, er også et vigtigt forskningsområde, dels for at kunne optimere på de teknologiske processer i slagterindustrien, dels for at kunne anvende pålidelige mærkningssystemer, således at forbrugeren får en kendt og ensartet kvalitet. DJF’s forskere har igennem de seneste år deltaget i en lang række proteomprojekter, der har belyst nogle af de protein- og peptidmønstre, der ændres i kødet under mørningsprocessen. Nogle af de fundne markører relaterer til mørhedsudviklingen i kødet, og en videre beskrivelse af, hvorledes disse markører kan bruges informativt i kødindustrien, forløber nu i samspil med internationale samarbejdspartnere. For et review omkring brugen af proteomics i kødforskningen henvises til Bendixen (2006).

Svinet som modelorganisme for humane sygdomme

Både fysiologisk og genetisk set er svin tættere beslægtet med mennesket end de dyr (oftest mus og rotter), der i dag bruges i stor udstrækning til dyremodeller for humane sygdomme. Igennem mange års genetiske og fysiologiske karakteriseringer af svin har vi adgang til dyr, der kan udnyttes til modelstudier, måske specielt til metabolisme og fedmeforskning. Danmark producerer hver år 20 mio. slagtesvin, hvilket udgør et fantastisk potentiale i etablering af bedre dyremodeller for humane sygdomme. Også kloning og markørbaseret avl er med til at øge potentialet for at udvikle modeldyr for humane sygdomme.

Beskrivelsen af modeldyrenes proteom ekspression er et vigtigt led i forståelsen af sygdomsmekanismerne. Igennem de seneste år har vi gennemført en lang række karakteriseringer af både lever-, muskel-, lunge- og tarm-proteomet fra svin, og igennem projekterne opbygget viden og robuste teknologiplatforme, der gør DJF stærkt rustet til at karakterisere biomarkører, også svinemodeller for humane sygdomme. 

Referencer:

Bendixen, E., (2006) The use of proteomics in meat science (Review) Meat science, 71, 138-149

Danielsen, M., Thymann, T., Jensen, B.B.,  Jensen, O.N. Sangild, P.T., and Bendixen, E. (2006)

Proteome profiles of mucosal immunoglobulin uptake in neonatal porcine gut. Proteomics, (in press)

Hedegaard, J., Horn, P., Lametch, R., Møller, H., Roepstorf, P., and Bendixen (2004) UDP-glucose pyrophosphorylase is upregulated in carriers of the porcine RN mutation in AMP-activated protein kinase. Proteomics, 4, 2448-2454

Fodnote:

Forkortelser: MALDI-TOF: Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight; LC: Liquid chromatography; HPLC:High pressure liquid chromatography; ESI: Electrospray ionisering; MS: Masse spektrometri; MS/MS: Tandem masse spektrometri.