Genetisk dissektion af ondartet lungesyge hos svin

Publiceret April 2006

Den klassiske selektion af avlsdyr i husdyrproduktionen er stort set baseret på fænotypiske observationer. Med moderne molekylær-genetiske metoder anvendt på avancerede avlsprogrammer er det blevet muligt at identificere og udnytte den specifikke genetiske variation bag den observerede fænotypiske variation. Dette muliggør en mere specifik selektion af avlsdyr, specielt i forbindelse med komplekse fænotyper, som f.eks. sygdomsresistens og andre egenskaber med en lav heritabilitet, der er vanskellige at avle for med den klassiske selektion. Som et eksempel på forskningen indenfor dette område, vil arbejdet med at identificere gener, der er relateret til forekomsten af ondartet lungesyge hos svin, blive præsenteret.

Ondartet lungesyge hos svin

Tre stadier af Ap infektion
Figur 1. Tre stadier af Ap infektion:
akut (nederst), subakut/kronisk
(midten) og kronisk (øverst). Billedet
er fra "USK Udvidet SundhedsKontrol
på slagtedyr" Gorm Christensen,
Landsudvalget for svin, Danske
Slagterier, 1997 og er gengivet med
tilladelse fra Danske Slagterier.

Infektioner af luftvejene er et af de hyppigst forekommende problemer i den moderne svineproduktion. En af disse infektioner er ondartet lungesyge, som er en smitsom form for lungebetændelse. Ondartet lungesyge forårsages af den Gram-negative bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae (Ap) og kan føre til omfattende skader på lungefunktionen da det inficerede lungevæv dør. Er større områder af lungen inficeret kan dyret dø i løbet af få timer, hvis det ikke behandles. Infektionen forløber typisk over 3-4 uger startende med en akut infektion som udvikler sig indenfor de første få døgn. Herefter heler det inficerede væv op til en kronisk infektion (figur 1).

Da betændelsen også omfatter lungehinden ses det ofte at lungerne gror fast til brysthulen. Dette betegnes brysthindear og observeres hyppigt i forbindelse med slagtningen af svin fra smittede besætninger. Se (Taylor, 1999) for yderligere information om Ap.

Genetisk variation og egenskaber

Af hensyn til dyrenes velfærd og produktionsomkostningerne er det ønskværdigt at nedbringe hyppigheden af ondartet lungesyge. Ondartet lungesyge forebygges ved at optimere eksempelvis indretning, miljø og drift. Der er endvidere udviklet vacciner til brug for forebyggelse af infektioner. En oplagt mulighed vil dog være at fremavle dyr med forøget resistens imod sygdommen.

I 1998 iværksatte Landsudvalget for Svin, Danske Slagterier, i samarbejde med Danmarks JordbrugsForskning (DJF), Afd. for Genetik og Bioteknologi, projektet ”Avl for Sundhed”, som havde til hensigt at skabe et grundlæggende materiale til beskrivelse af den genetiske variation i den aktuelle danske svinepopulation. Den hypotese, som blev testet ved hjælp af det indsamlede materiale i projekt ”Avl for Sundhed”, var, hvorvidt der i de udvalgte racer nedarves varianter af gener eller genkomplekser, som giver en signifikant effekt på grisenes resistens imod sygdomme samt forbedrer grisenes produktions- og kødkvalitetsegenskaber. Materialet er indsamlet i et forsøgsdesign, som optimerer muligheden for at finde sådanne gener eller genkomplekser og involverede 12 orner, der krydset med ca. 800 søer resulterede i et afkom på ca. 12.000 dyr. Alle dyr blev fulgt og registreret under opvæksten og ved slagtning, ligesom der blev udtaget mere end 40.000 blod og vævsprøver.

På baggrund af de indsamlede data blev der påvist forskelle i sygdomsfrekvens og produktionsresultater såvel mellem som inden for kuld. Denne genetiske variation er en forudsætning for igangsættelsen af et genomscan med henblik på at lokalisere gener og genkomplekser i svinets genom, som ligger til grund for de observerede fænotypiske forskelle i f.eks. resistens imod ondartet lungesyge. Relationen mellem genetisk og fænotypisk variation er ligeledes blevet undersøgt ved at studere ekspressions-profilerne i lungevæv og relatere disse til forskellige observationer.

For at karakterisere grisens immunsystem nærmere og studere det umiddelbare respons på infektion med Ap, er der i samarbejde med Danmarks Fødevare og Veterinær Forskning blevet gennemført et infektionsforsøg, hvor ekspressions-profilerne af inficerede og kontrol dyr er blevet analyseret.

Der er karakteriseret 15 forskellige serotyper of Ap og de almindeligst forekommende serotyper i Danmark er serotype 2, og 6. Under anvendelse af den nyeste sekventeringsteknologi har vi sekventeret det komplette genom af Ap serotyperne 2 og 6 blevet bestemt med henblik på bl.a. en beskrivelse af forskelle i virulens mellem serotyper.

DJFs deltagelse i det Dansk-Kinesiske Svine Genom Projekt (Jorgensen et al., 2005; Wernersson et al., 2005) er en del af grundlaget for gennemførelsen af de ovennævnte studier, idet projektet har resulteret i genmarkører til brug for et genomscan samt et stort antal cDNA kloner til fremstilling af cDNA microarrays (figur 2).

2006_2 lungesyge_2.jpg
Figur 2. Microarray (DIAS_PIG_55K3_v1) hybridiseret med Alexa-488 opmærket grise lever RNA. Forstørret ses et enkelt sub-array ud af i alt 48. DIAS_PIG_55K3_v1 består af 55.548 spots: 26.877 PCR produkter fra cDNA kloner og 867 kontrol spots, alle printet i duplika som nabospots i et 4x12 array af sub-arrays, som hver består af 34x34 spots. cDNA klonerne blev udvalgt fra cDNA bibliotekerne lavet i forbindelse med det Dansk-Kinesiske Svine Genom Projekt ved hjælp af BLASTN (P ≤ 10-8) således at flest mulige humane gener i NCBI's RefSeq database, release 15 var repræsenteret. Derudover blev der udvalgt en række cDNA kloner som repræsenterede ikke karakteriserede gener og mulige svine-specifikke gener. Kontrol spots består af "positive" spots, blanke (spotting buffer) og udvalgte spots fra Lucidea Universal ScoreCard (GE Healthcare). Arrays er printet på UltraGAPS slides (Corning Incorporated) med en SDDC-2 MicroArrayer (BioRad) med 48 x 946 MP2.5 spotting pins (Telechem International).

Et oligonukleotide baseret microarray er p.t. under produktion. Microarrayet består af 24.710 oligonukleotider (70-mer) designet til hver at repræsentere et grise gen samt et antal kontrol elementer. Oligonukleotiderne var designet med programmet SEPON (Hornshoj et al., 2004) og OligoArray 2 (Rouillard et al., 2003).

Yderligere information om cDNA microarrays fremstilles ved DJF kan findes på GeneExpression Omnibus (http://www.ncbi.nih.gov/geo/) under accession numrene GPL3594 (DIAS_PIG_27K2_v2), GPL3585 (DIAS_PIG_55K2_v1) og GPL3608 (DIAS_PIG_55K3_v1).

Identifikation af Gener (QTL) med indflydelse på resistens imod ondartet lungesyge

Alle 12.000 dyr fra projektet ”Avl for Sundhed” er blevet genotypebestemt for mere end 750 markører spredt over hele genomet. Et sådant genomscan omfatter typning af dyrene for et stort antal genmarkører og derefter en analyse af nedarvningen af disse genmarkører ved associationsstudier og QTL-analyser, hvor de fænotypiske resultater sammenholdes med genmarkørerne i en avanceret biometrisk analyse. Data fra dette meget store genomscan bliver brugt til at lokalisere og identificere gener og genkomplekser i svinets genom, der er årsag til fænotypiske forskelle i sygdomsresistensen. Studiet involverer mere end 7 millioner genotypninger og har resulteret i fundet af 5 genomiske regioner (QTL) med signifikant indflydelse på resistensen imod Ap. Der er i øjeblikket ved at blive planlagt valideringstudier for disse QTLer med henblik på udvikling af markørbaserede test for selektion af resistente dyr i avlsarbejdet.

Arvelighed i ekspression

En undersøgelse af arvelige forskelle i genekspression, vil potentielt kunne bidrage til identifikationen af den specifikke genetiske variation bag den observerede fænotypiske variation. For at studere generelle arvelige forskelle i ekspression samt søge at relatere disse til resistens imod ondartet lungesyge, blev ekspressionsprofiler af lungevæv undersøgt ved hjælp af cDNA microarrays og 2D-protein elektroforese på udvalgte dyr fra ”Avl for Sundhed”. De udvalgte dyr var alle fra den samme besætning og stammede fra to forskellige orner med høj hhv. lav forekomst af brysthindear hos afkommet. De blev udvalgt således at forsøget var balanceret med hensyn til de tre faktorer: orne-linie, forekomst af brysthindear og køn. Ekspressionsprofilerne blev analyseret og viste, for begge teknikker, at orne-linie havde den største effekt, mens køn og forekomst af brysthindear havde mindre effekt. Dette forsøg viser således at der er tydelige arvelige effekter i ekspressionsprofilerne. En inddragelse af ekspressionsdata i associationsstudierne vil bidrage til identifikation af gener og genkomplekser, som er baggrund for fænotypiske forskelle i f.eks. sygdomsresistensen og støtte identifikation af kandidatgener i de 5 ovennævnte QTL-områder.

Eksperimentel infektion af svin med Ap

For at karakterisere grisens umiddelbare respons på infektion nærmere, blev grise eksperimentelt inficeret med Ap serotype 5. Infektionen samt prøve-udtagning og behandling blev foretaget af Danmarks Fødevare og Veterinær Forskning (DFVF-kontakt: Peter Heegaard, pmhh@dfvf.dk). De inficerede grise blev slagtet og obduceret efter 24 timer og udviste alle typiske lungelæsioner. Der blev udtaget prøver af sygt og raskt lunge-væv fra de inficerede dyr samt lunge lymfe knuder og lever-væv fra inficerede samt ikke-inficerede kontrol dyr. Ekspressionsprofilerne af det udtagne væv blev undersøgt ved hjælp af cDNA microarrays. Normalisering og statistisk analyse viste at 100 - 700 gener var signifikant differentielt udtrykt mellem inficeret/raskt væv afhængig af vævstype. En umiddelbar gennemgang af resultaterne viste, som forventet, at ekspressionen af gener med relation til immune-responset var påvirket. Således var gener kodende for interleukiner, chemokiner og forkellige komponenter af komplement systemet opreguleret i inficeret lunge-væv mens adskillige akut fase proteiner var opreguleret i lever-væv fra inficerede dyr. En test for overrepræsentation af specifikke Gene Ontology (GO)-termer indenfor ”Biological Process” (www.geneontology.org) blandt opregulerede gener fra lever-væv, viste at grupper af gener relateret til immune responset som f.eks. “response to stimulus”, “response to stress”, “response to biotic stimulus”, “defense response”, “immune response”, “response to wounding” og “acute phase response” var signifikant overrepræsenterede. Videre analyse af de opnåede resultater kan potentielt føre til ny viden om grisens immune respons og yderligere bidrage til identifikation af de gener, hvori genetisk variation har en betydning for dyrenes resistens..

Sekventering af Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 6 og 2

Med henblik på at opnå en detaljeret forståelse af patogenet Ap og dets interaktion med værtscellerne, herunder forskellene mellem de forskellige serotypers virulens, har vi sekventeret genomerne for Ap serotype 2 og 6.  Selvom størrelsen af Ap-genomet er på ca. 2,3 millioner basepar, så var det muligt at gennemføre selve sekventeringen på ca. 14 dage per genom ved hjælp af en ny sekventeringsteknologi baseret på hyper-parallel pyrosekventering (Genome Sequencer GS-20 fra Roche Life Sciences) der som det første sted i Skandinavien er blevet etableret ved Sektion for Molekylær Genetik og Systembiologi ved DJF. GS-20 muliggør parallel sekventering af op til 300.000 sekvenser på omkring. 100 basepar hver i løbet af et par dage, i alt ca. 30 mill. basepar. Komplet sekventering (20X) af Ap-genomet var således muligt ved bare to kørsler på instrumentet. Denne nye teknologi (se figur 3) betyder en 10-100X forøgelse af sekventeringskapaciteten ved DJF og åbner op for en lang række nye muligheder inden for genomsekventering, resekventering og SAGE-baseret transkriptionsanalyse.

Hyperparallel pyrosekventering med Genome Sequencer 20
Figur 3. Hyperparallel pyrosekventering med Genome Sequencer 20 (Margulies et al 2005). Sekventeringsprocessen med GS-20 består i princippet af 4 trin: forberedelse af et enkeltstrenget DNA bibliotek, efterfulgt af en klonal amplifikation af de individuelle fragmenter (single molecule PCR) ved hjælp af emulsion-PCR. Derefter sekventeres de enkelte fragmenter på beads i nano-wells ved hjælp af pyrosekventering (sequencing by synthesis). Signalet fra pyrosekventeringen i hver nano-well registreres af et højopløseligheds CCD kamera. Større gengivelse.

Der forestår nu et stort arbejde med annoteringen af genomerne fra Ap-2 og Ap-6 serotyperne med henblik på, at forstå forskellene i deres interaktion med værtscellen, at forbedre den molekylære forståelse af patogenets biologi og diagnostik, samt at skabe mulighed for etablering af patogen-specifikke mikroarrays og lignende forskningsressourcer.

Litteratur:

Hornshoj, H., Stengaard, H., Panitz, F., Bendixen, C., 2004. SEPON, a Selection and Evaluation Pipeline for OligoNucleotides based on ESTs with a non-target T-m algorithm for reducing cross-hybridization in microarray gene expression experiments. Bioinformatics. 20, 428-429.

Jorgensen, F.G., Hobolth, A., Hornshoj, H., Bendixen, C., Fredholm, M., Schierup, M.H., 2005. Comparative analysis of protein coding sequences from human, mouse and the domesticated pig. Bmc Biology. 3.

Rouillard, J.M., Zuker, M., Gulari, E., 2003. OligoArray 2.0: design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using a thermodynamic approach. Nucleic Acids Research. 31, 3057-3062.

Taylor, D. J. 1999, ”Actinobacillus pleuropneumoniae,” in Diseases of swine, 8th ed edn, B. E. Straw et al., eds., Iowa State University Press, Ames, Iowa.

Wernersson, R., Schierup, M.H., Jorgensen, F.G., Gorodkin, J., Panitz, F., Staerfeldt, H.H., Christensen, O.F., Mailund, T., Hornshoj, H., Klein, A., Wang, J., Liu, B., Hu, S.N., Dong, W., Li, W., Wong, G.K.S., Yu, J., Wang, J., Bendixen, C., Fredholm, M., Brunak, S., Yang, H.M., Bolund, L., 2005. Pigs in sequence space: A 0.66X coverage pig genome survey based on shotgun sequencing. BMC Genomics. 6.