Få artikler siden sidst – godt eller skidt?

Publiceret Oktober 2004

Denne omgang af Siden Sidst belyser problemerne i de beslutninger som SiSi redaktionen må foretage i udvalget af artikler. For det første foretager vi subjektive valg i hvad der hører under molekylærbiologisk og biokemisk forsking, og vi har således i denne omgang fravalgt både mere fysiologiske og evolutionsbiologiske artikler. Dernæst har vi haft som kriterium at den beskrevne forsking skal være ”dansk”. Men det er klart at forskning i dag heldigvis ofte foretages som internationale samarbejder og grænsen for hvad der er dansk derfor nemt kan blive flydende.

Vores udgangspunkt er at førsteforfatteren, samt en korresponderende forfatter skal befinde sig på en dansk forskningsinstitution, omend disse retningslinier ikke altid bliver fulgt fuldkomment stringent. Men alligevel har dette krav om ”danskhed” af den beskrevne forskning gjort, at vi i denne omgang af SiSi har måttet vælge flere artikler fra, som dog alligevel havde et vist dansk bidrag. Så een af årsagerne til det lave antal artikler denne gang er, at kun få artikler var danske nok til at opfylde vore kriterier.

Et sidste, men ikke mindre problem i udvælgelsen af artiklerne, er at den foregår manuelt. Den kan derfor, som alt andet arbejde, være behæftet med menneskelige fejl. Derfor missede vi desværre een af de artikler, der egentligt burde have med i sidste udgave af SiSi, men som vi istedet lister nedenfor. I denne omgang giver vi plads til beskrivelsen af en massespektrometrisk metoder til analyse af peptider.

Masser af massespektrometri

Improved peptide identification in proteomics by two consecutive stages of mass spectrometric fragmentation

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13417-13422 (2004)
Jesper V. Olsen and Matthias Mann, Syddansk Universitet

Gode analyse-metoder er det essentielle grundlag som biokemisk og molekylærbiologisk forskning bygger på. Det er derfor ikke overraskende at udvikling af disse metoder giver ophav til nogle af de allermest citerede artikler i litteraturen. På Center for Eksperimentel Bioinformatik på Syddansk Universitet har forskerne i flere år udviklet og udnyttet massespektrometriske metoder til at studere vigtige biologiske problemstillinger især indenfor analysen af proteomer, og denne artikel beskriver en vigtig videreudvikling af denne metodik.

En god analytisk metode skal helst både være nøjagtig og følsom. Men hvis den skal benyttes til at generere store mængder data som f.eks. i proteom studier, skal den også gerne være hurtig at foretage, og både udførslen og efterfølgende analyse af de resulterende data skal kunne automatiseres. Massespektrometri (MS) har vist sig at kunne opfylde de fleste af disse kriterier og er derfor blevet et af de foretrukne værktøjer i eksperimentelle studier af proteiners ekspression. En typisk situation kunne være at man ønskede at identificere hvilke proteiner der er tilstede i en celle under et givent sæt betingelser. En MS strategi til at besvare dette spørgsmål kunne være at (i) ekstrahere proteiner, (ii) omdanne disse proteiner til peptidfragmenter ved hjælp af specifikke proteaser, (iii) separation af peptiderne ved kromatografiske metoder og (iv) identifikation af peptiderne ved hjælp af MS. Det er dette sidste og vigtige trin at forskerne fra Syddansk Universitet nu har forbedret.

Den simpleste metode til at identificere peptider ved hjælp af MS kunne være at bruge peptidets masse samt kendskabet til den anvendte proteases specificitet til at søge efter mulige protein kandidater i sekvens databaser. Denne metode er dog ikke specielt velegnet da mange peptider ville have samme masse (eller rettere masse/ladnings forholdet m/z) inden for den eksperimentelle usikkerhed. For at forøge nøjagtigheden i identifikationen af korrekte peptider benytter man derfor ofte såkaldte MS/MS teknikker. I disse metoder fragmenteres peptidet i massespektrometeret f.eks. ved kollision med en inert gas, og m/z forholdet af de resulterende peptidefragmenter bestemmes ved endnu en omgang MS – heraf navnene MS/MS, MS2 eller tandem-MS. Hvis f.eks. peptidet har sekvensen LNCGQVDSK ville traditionel MS alene give massen af peptidet, mens MS/MS ville give massen af peptidet samt af de fragmenter (f.eks. LNCGQVDS, LNCGQVD, LNCGQV, NCGQVDSK, CGQVDSK, GQVDSK etc) som dannes efter kollision med den inerte gas. Ved at bruge informationen om det fulde (precursor) peptids masse, samt massen af de kollisionsinducerede peptiders masse kan man opnå langt højere sikkerhed i database søgninger og dermed i identifikationen af proteiner.

Under ideelle betingelser ville sådanne MS/MS metoder sikkert kunne give tilstrækkeligt med information til at identificere de fleste proteiner i komplekse blandinger. Men dels er den eksperimentelt bestemte masse vedhæftet en eksperimentel usikkerhed, dels er der altid andre ”fejlkilder” såsom baggrundsstøj i spektrene, uspecifik spaltning af proteaser og post-translationelle modifikationer der giver årsag til usikkerhed i identifikationen af peptider. Den logiske videreudvikling af MS teknikken for at forøge nøjagtigheden er derfor MS/MS/MS (MS3) hvor de peptider der dannes under den første omgang MS/MS fragmenteres endnu en gang og giver ophav til endnu en serie af peptider hvis masse kan bestemmes. I eksemplet ovenfor kunne precursor peptidet LNCGQVDSK blandt andet fragmenteres til peptidet LNCGQV i første omgang MS/MS. Fragmenteres dette peptid igen (MS3) kunne dette f.eks. give ophav til peptiderne LNCGQ, LNCG, LNC etc. På denne måde kan man opbygge information om et helt ”træ” af peptid-masser hvor man i hvert tilfælde kender massen af precursor peptidet. Det er netop denne type af peptid identifikation ved hjælp af MS3 som forskerne fra Syddansk Universitet har udviklet.

Forskerne viser først og fremmest at man vha. af et såkaldt ”linear quadrupole ion trap-Fourier transform” (LTQ-FT) massespektrometer kan optage MS3 spektre af peptider og at disse indeholder yderligere information om sekvensen af peptidet som gør identifikationen mere sikker. Men som nævnt ovenfor skal gode analytiske metoder også have andre egenskaber end præcision. De viser derfor også at det ekstra fragmenterigstrin der kræves i MS3 i forhold til MS2 ikke kræver ekstra analyse tid, da denne kan udføres samtidigt med at massespektrometeret optager en mere præcis masse af precursor ionen. En kort analysetid er vigtig, dels fordi man skal kunne køre mange prover igennem, men også fordi peptiderne skal kunne analyseres ”on-the-fly” mens de kommer af en kromatografisk søjle. En anden vigtig egenskab er følsomheden i analysen, specielt i studier af protein ekspression i vanskeligt tilgængelige prøver. Da man uværgeligt taber peptid i fragmenteringstrinene kunne man forvente at MS3 ville være væsentligt mindre følsomt en MS2. Men da man samtidigt mindsker baggrunden ved kun at kigge på et enkelt peptid ad gangen mindsker man også baggrundsstøjen og signal-støj forholdet forringes derfor ikke så meget. F.eks. viser forskerne at man kan analysere peptidmængder mindre end 1 fmol med deres MS3 metode, og således analysere meget små mængder af protein f.eks. fra vævsproever.

Da formålet med denne MS3 metode er at kunne identificere peptider i komplekse blandinger er det oplagt at der kræves automatiserede metoder til at analysere de resulterende data. Derfor er det da også godt at forskerne beskriver en ny algoritme til at analysere data fra MS3 eksperimenter automatisk. Groft sagt er det en probabilistisk metode der kvantificerer hvor stor sandsynligheden er for at et givent peptid giver ophav til et bestemt sæt af MS2 og MS3 spektre. Mindst lige så godt er det at forskerne følger den stigende og vigtige trend det er at gøre deres software offentligt tilgængeligt for alle andre. Deres MSQuant program kan således downloades gratis via http://msquant.sourceforge.net/ inklusive kildekoden til programmet så andre forskere frit kan benytte og videreudvikle programmet og dermed forhabentligt gøre MS3 metoder til proteom studier endnu bedre.

Andre artikler

The phagocyte NADPH oxidase depends on cholesterol-enriched membrane microdomains for assembly

EMBO Journal 23: 739-748 (2004)
Frederik Vilhardt, Bo van Deurs, Københavns Universitet

Modulation of Transcription Affects mRNP Quality

Molecular Cell 16: 235-244 (2004)
Torben Heick Jensen, Jocelyne Boulay, Jens Raabjerg Olesen, Jessie Colin, Michael Weyler, Domenico Libri, Aarhus Universitet og CNRS Gif-sur-Yvette, Frankrig