Siden sidst: Tilbage med en frugtbar høst

Publiceret Juli 2004

Siden sidst er tilbage efter en pause på et par numre og dækker derfor denne gang en noget større periode end normalt, fra ca. december 2003 til august 2004. Som man kunne forvente af denne lange periode er høsten mere frugtbar end normalt og omfatter bl.a. arbejder publiceret i Cell (1), Science (2), Nature (2), Nature Cell Biology (1), EMBO Journal (1) og Journal of Cell Biology (2). Vi gør comeback med et strukturarbejde samt et indslag i debatten om dannelse af disulfidbroer i cytosoliske proteiner.

Mekanisme for ATP-dreven calcium transport

Phosphoryl transfer and calcium ion occlusion in the calcium pump

Science 304 (2004), 1672-1675
T L-M Sørensen, JV Møller, P Nissen. Aarhus Universitet.

Langt de fleste af cellens biokemiske reaktioner forløber ikke spontant. I mange tilfælde skyldes dette, at aktiveringsenergien er så høj, at den ønskede reaktion ikke kan forløbe ved simpel kollision mellem reaktanterne. Dette kinetiske problem løses typisk ved enzymkatalyse alene. I andre situationer er problemet af termodynamisk karakter: De ønskede produkter kan end ikke dannes ved katalyse, fordi deres kemiske potential er højere end reaktanternes. I dette tilfælde kræves kobling af en termodynamisk favorabel reaktion til den ufavorable, ønskede reaktion, så der kommer til at stå et samlet hop nedad på potentialstigen på bundlinjen.

I biokemien er den termodynamisk favorable reaktion i reglen ATP hydrolyse, og den kemiske koblingsmekanisme er i mange tilfælde relativt simpel, som fx dannelse af intermediære phosphorsyreanhydrider med højt kemisk potential, der så kan reagere videre under dannelse af de ønskede produkter. Et eksempel fra nukleotidstofskiftet kunne være syntesen nukleotider (fx GMP) ud fra ribose-5-phosphat og en nukleobase (fx guanin). I andre tilfælde som iontransport mod en elektrokemisk potentialgradient er mekanismerne langt vanskeligere at gennemskue. I dette arbejde angriber forfatterne en sådan problemstilling af stor fysiologisk relevans – den ATP-drevne transport af calciumioner over den endoplasmatiske reticulum (ER) membran – og løser den ved bestemmelse af et sæt af krystalstrukturer af calciumpumpen i komplex med to forskellige ATP-analoger.

Den sarco(endo)plasmatisk reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) er nødvendig for genoptagelse af Ca2+ frigivet til cytosolen i forbindelse med muskelkontraktion eller som led i intracellulær signal transduktion. Tidligere strukturarbejde med SERCA har vist, at to calciumioner bindes i centrum af de 10 transmembrane segmenter, men også at den cytosoliske del af molekylet har en åben konformation, der tillader frigivelse af Ca2+ på begge sider af membranen. I modsætning hertil har den ikke-Ca2+-bundne form en kompakt, lukket konformation. På baggrund af disse strukturer kan det lidt diffuse spørgsmål, om hvordan ATP hydrolyse driver Ca2+ transport imod dens koncentrationsgradient således formuleres mere præcist som, hvordan nukleotidbinding og phosphatoverførsel i SERCA driver den åbne Ca2+-bundne konformation mod en cytoplasmatisk lukket konformation klar til at frigive Ca2+ på ER-siden.

For at besvare dette spørgsmål krystalliserer forfatterne to forskellige Ca2+- SERCA-komplekser til strukturbestemmelse: Det ene med en ikke-hydrolysérbar ATP analog (adenosin-b-g-methylen triphoshat, AMPPCP) for at kigge på effekten af nukleotid-binding alene; det andet med ADP:AlF4-, der kan imitere ATP hydrolysens højenergi aspartyl-phosphoryl intermediat.

Udover et væld af interessante detaljer om hvordan ATP hydrolysen foregår – fx med en meget vigtig deltagelse af to Mg2+-ioner – fører disse strukturer også til en model for selve koblingsmekanismen. Allerede i den nukleotidbundne form ses omfattende domænebevægelser sammenlignet med den ikke-bundne form, og to transmembrane helices omkring calciumbindingssitet flyttes så en kompakt, lukket struktur opnås med en hydrofob ”prop” bag de bundne calciumioner. ADP:AlF4- komplekset har en næsten – men også kun næsten – identisk struktur, idet forfatterne observerer en række små forskelle i nukleotidbindingen. Disse forskelle har tilsyneladende stor betydning, for forfatterne viser med at smukt biokemisk forsøg, at SERCA-ADP: AlF4- komplekset i modsætning til AMPPCP komplekset er i stand til effektivt at holde på bundne, radioaktivt mærkede Ca2+-ioner. En mulig forklaring på denne forskel kan ligge i forskellig grad af strukturel fluktuation, hvilket understøttes af, at kun ADP:AlF4- komplekset er fuldstændig proteinase K resistent og har stærkt reduceret reaktion med Ellman’s reagens for frie thioler.

Forfatternes malende konklusion bliver derfor, at selve ATP-bindingen i calciumpumpen lukker døren efter calciumionerne, mens phosphatoverførslen låser den.

Svovl-broer – hvorfor ikke?

Monitoring disulfide bond formation in the eukaryotic cytosol.

Journal of Cell Biology 166 (2004), 337-345.
H Østergaard, C Tachibana, JR Winther. Carlsberg Laboratoriet, København.

I første omgang af SiSi i 2002 beskriv vi hvordan forskergruppen på Carlsberg havde udviklet en ny sensor for den intracellulære redox-tilstand. Ved hjælp af rationelt design havde forskerne indsat et par cysteiner i en gult fluoriserende variant af green flurosecent protein (varianten kaldtes rxYFP). Disse to cysteiner kunne reversibelt danne en disulfid-bro, og redox status af rxYFP (thiol eller disulfid) kunne monitoreres ved fluorescens målinger. Ved at udtrykke rxYFP i E. coli celler og derefter måle fluorescens på cellesuspensioner kunne forskerne måle den intracellulære redox tilstand. I modsætning til bakterier som E. coli er cellerne i eukaryote organismer derimod opdelt i forskellige compartments, og det har længe været kendt at i sådanne celler findes der stort set kun svovlbroer i sekretoriske proteiner, der har været igennem det endoplasmatiske reticulum (ER). Den klassiske forklaring på dette fænomen har været, at mens ER har et stærkt oxiderende miljø, der favoriserer dannelsen af svovlbroer, så er cytosolen i eukaryoter derimod reducerende. Denne konklusion er dog primært baseret på et arbejde fra 1992 (Hwang et al, Science 257: 1496), hvor koncentrationen af den reducerede (GSH) og oxiderede (GSSG) form af den intracellulære ”redox-buffer” glutathion blev målt i celle lysater med mulighed for en række artefakter.

I arbejdet publiceret i J Cell Biol benytter forskerne rxYFP til at måle redox tilstanden af glutathion i cytosolisen i Saccharomyces cerevisiae. De finder, at i vild-type gær udgør oxideret glutathion ca. 4% af den samlede glutathion mængde. Ydermere viser forskerne, at det er muligt at manipulere glutathion mængderne dramatisk på forskellig vis. Ved f.eks. at slå genet for glutathion reductase ud i kombination med at tvinge gær til at bruge GSSG som svovl-kilde viser de at op til 70% af glutathion i cytosolen kan findes på den oxiderede GSSG form. Dernæst viser forskerne ved en kombination af in vitro og in vivo målinger, at rxYFP er et direkte substrat for glutathion, og at reaktionen er katalyseret af de cytosoliske proteiner glutaredoxin (Grx). Mens ligevægten mellem reduceret og oxideret rxYFP alene er en funktion af forholdet mellem koncentrationerne af reduceret og oxideret glutathion, er kinetikken for omdannelsen mellem reduceret og oxideret rxYFP en funktion af de absolutte koncentrationer af GSH og GSSG. Med et kendskab til mekanismen for reaktionen samt hvilke proteiner der katalyserer den, giver det forskerne et redskab til at måle de absolutte koncentrationer af GSH og GSSG i cytosolen. Ved at slå generne ud for Grx ud og måle kinetikken for omdannelsen fra reduceret til oxideret rxYFP kunne koncentrationerne af GSH og GSSG estimeres til at være ca. 13 og 0.17 mM respektivt. En vigtig konklusion fra arbejdet er dog at disse to tal ikke giver den fulde sandhed om redox-potentialet i cytosolen. Det viser sig nemlig at i fraværet af thiol-disulfid isomeraser og oxidoreductaser at oxidations og reduktions reaktionerne er endog meget langsomme. Det giver mulighed for at disulfid-bro dannelsen i mange tilfælde kan være under kinetisk kontrol og ikke være bestemt af det thermodynamiske redox-potential af glutathion bufferen. De foreslår derfor at manglen af disulfid-broer i cytosolen ikke alene skyldes de reducerende forhold, men derimod manglen på katalyserende enzymer, og at denne mangel kan være en konsekvens af et evolutionært pres, af endnu ukendte årsager, for ikke at danne svovl-broer i cytosolen.

Andre artikler

RNA and RNA binding proteins participate in early stages of cell spreading through spreading initiation centers.

Cell 117 (2004), 649-662.
CL de Hoog, LJ Foster, M Mann. Syddansk Universitet; Odense.

Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.

Nature 426 (2004), 570-574.
JS Andersen, CJ Wilkinson, T Mayor, P Mortensen, EA Nigg, M Mann. Syddansk Universitet, Odense; Max Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Tyskland.

Sortilin is required for proNGF-induced neuronal cell death.

Nature 427 (2004), 843-848.
A Nykjaer, R Lee, KK Teng, P Jansen, P Madsen, MS Nielsen, C Jacobsen, M Kliemannel, E Schwarz, TE Willnow, BL Hempstead, CM Petersen. Aarhus Universitet; Cornell University, USA; Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin, Tyskland; Martin Luther Universität, Halle, Tyskland.

Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic.

Science 305 (2004), 239-242.
M Leist og 27 andre forfattere. H Lundbeck A/S med 6 andre institutter og virksomheder.

Centrosome-associated Chk1 prevents premature activation of cyclinB-Cdk1 kinase.

Nature Cell Biology. August 2004.
A Krämer, N Mailand, C Lukas, RG Syljuåsen, CJ Wilkinson, EA Nigg, J Bartek, J Lukas. Kræftens Bekæmpelse; University of Heidelberg, Tyskland; Max Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Tyskland.

Evidence for lateral gene transfer from salmonids to two Schistosome species.

Nature Genetics 36 (2004), 786-787.
P Melamed, KL Chong, MV Johansen. Danish Bilharziasis Laboratory, Charlottenlund; National University of Singapore.

The fission yeast heterochromatin protein Rik1 is required for telomere clustering during meiosis.

Journal of Cell Biology 165 (2004), 759-765.
CT Tuzon, B Borgstrom, D Weilguny, R Egel, JP Cooper, O Nielsen. Molekylærbiologisk Institut, Københavns Universitet; Telomere Biology Laboratory, UK; University of Colorado, USA.

Mdc1 couples DNA double-strand break recognition by Nbs1 with its H2AX-dependent chromatin retention.

EMBO Journal 23 (2004), 2674-2683.
C Lukas, F Melander, M Stucki, J Falck, S Bekker-Jensen, M Goldberg, Y Lerenthal, SP Jackson, J Bartek, J Lukas. Kræftens Bekæmpelse; Cambridge University, UK; Tel Aviv University, Israel.

Glutamate-183 in the conserved TGES motif of domain A of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase assists in catalysis of E2/E2P partial reactions.

PNAS 101 (2004), 2776-2781.
JD Clausen, B Vilsen, DB McIntosh, AP Einholm, JP Andersen. Aarhus Universitet; University of Cape Town, Sydafrika.

Camalexin is synthesized from indole-3-acetaldoxime, a key branching point between primary and secondary metabolism in Arabidopsis.

PNAS 101 (2004), 8245-8250.
E Glawischnig, BG Hansen, CE Olsen, BA Halkier. Kongelige Veterinær- og Landbohøjskole; Technical University Munich.

Crystal structure of HLA-DQ0602 that protects against type 1 diabetes and confers strong susceptibility to narcolepsy.

PNAS 101 (2004), 1999-2004.
C Siebold, BE Hansen, JR Wyer, K Harlos, RE Esnouf, A Svejgaard, JI Bell, JL Strominger, EY Jones, L Fugger. Skejby Sygehus, Aarhus; Rigshospitalet, København; University of Oxford, UK; Harvard University, USA.

Dissociation of spikes, synaptic activity, and activity-dependent increments in rat cerebrellar blood flow by tonic synaptic inhibition.

PNAS 100 (2003), 16000-16005.
K Caesar, K Thomsen, M Lauritzen. Panum Instituttet, Københavns Universitet; Glostrup Hospital.

A plant plasma membrane Ca2+ pump is required for normal pollen tube growth and fertilization.

PNAS 101 (2004), 9502-9507.
M Schiøtt, SM Romanowsky, L Bækgaard, MK Jakobsen, MG Palmgren, JF Harper. Kongelige Veterinær- og Landbohøjskole; Scripps Research Institute, USA; University of Nevada, USA.

Retinoblastoma protein functions as a molecular switch determining white versus brown adipocyte differentiation.

PNAS 101 (2004), 4112-4117.
JB Hansen, C Jørgensen, RK Petersen, P Hallenborg, R De Matteis, HA Bøye, N Petrovic, S Enerbäck, J Nedergaard, S Cinti, H te Riele, K Kristiansen. Syddansk Universitet, Odense; The Netherlands Cancer Institute, Holland; University of Ancona, Italien; Stockholm University, Sverige, Göteborg University, Sverige.