En hilsen fra Dolly til stamcelleforskningen

Publiceret April 2003

Da fødslen af det klonede lam, Dolly, rapporteredes i foråret 1997 (Wilmut et al., 1997) blev et af udviklingsbiologiens dogmer aflivet: At differentierede celler ikke kan de-differentieres igen. Det står på nuværende tidspunkt klart, at fænomenet kloning er så komplekst, at vi med vor øjeblikkelige indsigt og forskning kun kradser lidt i lakken. Et faktum, som volder stor bekymring, er, at kun få procent af de tilvirkede klonede embryoner er i stand til at udvikle sig til levendefødt afkom.

Der er gennem de seneste år fremkommet nye forskningsresultater, som peger lidt i retningen af, hvad der sker, når arvemassen (genomet) i en kropscelle re-programmeres og re-differentieres ved kloning. Denne viden kan dels være af stor betydning for mulighederne for at forbedre kloningsteknikken, men den kan også få skelsættende betydning for udviklingen af terapi baseret på stamceller. I bund og grund åbner den genomiske re-programmering muligheden for at omdanne én celletype til en anden og hermed fremstille terapeutiske cellepopulationer ved såkaldt transdifferentiering. Det er sigtet med denne artikel at sammenfatte de væsentligste cellebiologiske og molekylære forhold ved kloning samt at trække de mest markante videnskabelige og samfundsmæssige perspektiver heraf op.

Tekniske aspekter af kloning ved kernetransplantation

Kernetransplantationens omdrejningspunkt er den ubefrugtede ægcelles (oocytens) særlige egenskaber til re-programmering af genomet i andre celler. I forbindelse med befrugtningen re-programmerer oocyten således både sit eget genom samt det, som den modtager fra sædcellen, til den sekventielle genekspression, som styrer embryonal- og fosterudviklingen. Oocyten har imidlertid også vist sig i stand til at re-programmere andre cellers, f.eks. kropscellers, genom. Kloning ved kernetransplantation benytter sig af netop dette forhold. Populært sagt resulterer re-programmeringen af kropscellens genom i, at det kernetransplanterede embryo udvikler sig, som om det var "befrugtet" med den ilagte cellekerne i stedet for med en sædcelle.

 

Kloning ved kernetransplantation
Figur 1. Kloning ved kernetransplantation. Øverst tømmes en kvægoocyt ved et mikrokirurgisk indgreb under mikroskop for arvemassen (genomet), hvorved en cytoplast er dannet. Cytoplasten føres sammen med den kernedonor (karyoplast), som ønskes klonet. Karyoplasten kan komme fra et tidligt embryo (A), fra en cellekultur af celler fra et embryo (B), fra en cellekultur af somatiske celler fra et foster (C) eller fra en cellekultur af somatiske celler fra f.eks. yveret af et voksent dyr (D). Cytoplast og karyoplast elektrofusioneres, og det rekonstruerede embryo begynder sin udvikling.

I de tidligste forsøg benyttedes celler fra tidlige embryoner til kernetransplantation (Willadsen et al., 1986). Teknikken bestod i, at den modne oocyt blev frataget sit genom ved et mikrokirurgisk indgreb. Resten af oocyten, den såkaldte cytoplast, fusioneredes derefter med kernedonorcellen, den såkaldte karyoplast (Fig. 1A). Fusionen udløstes af et elektrisk stød, som påvirkede cellemembranerne. Herved opstod et såkaldt rekonstrueret embryo, som påbegyndte en fornyet udvikling. Senere lykkedes det at klone får ved kernetransplantation fra cellelinier, som var etableret fra blastocyster (Campbell et al., 1996; Fig. 1B), og til slut lykkedes det at anvende cellelinier, som var etableret fra kropsceller (somatiske celler) fra enten fostre eller voksne individer; i Dollys tilfælde fra yveret (Wilmut et al., 1997; Fig. 1C, D).

Resultaterne af kloning fra somatiske celler

På trods af at det i løbet af få år lykkedes at klone får(Wilmut et al., 1997), kvæg (Cibelli et al., 1998), geder (Baguisi et al., 1999), mus (Wakayama et al., 1998), svin (Poleajeva et al., 2000), kanin (Chesne et al., 2002) og kat (Shin et al., 2002) ved kernetransplantation fra somatiske celler fra voksne individer, stod det hurtigt klart, at medaljen havde en bagside. Kloning ved kernetransplantation fra somatiske celler var og er forbundet med en markant reduceret evne til embryonaludvikling, forøget abortfrekvens gennem hele drægtighedsforløbet samt med fødsel af afkom, som enten er for stort, har forskellige alvorlige patologiske forandringer eller nedsat levedygtighed (sammenfattet i syndromet "large offspring syndrom", Heyman et al., 2002). De seneste par års undersøgelser har vist, at patologisk udvikling af moderkagen (placenta) er en hovedårsag til disse problemer (Hill et al., 2000; De Sousa et al., 2001; Heyman et al., 2002).

Molekylære aspekter af den genomiske reprogrammering

Det står på nuværende tidspunkt klart, at den genomiske re-programmering, som finder sted i cytoplasten, ofte er forbundet med afvigende genekspression. De molekylære mekanismer, som ligger til grund herfor, synes at hænge direkte sammen med epigenetiske forhold under re-programmeringen af genomet. Methylering af DNA-nukleotidet cytosin er dybt involveret i reguleringen af genekspression, således at højt methylerede områder af DNA ikke eksprimeres (for udmærket dansk oversigt se Fenger og Vaag, 1999). Nyere undersøgelser har vist, at både det maternelle og det paternelle genom demethyleres kraftigt umiddelbart efter befrugtningen for siden at re-methyleres (Mann og Bartolomei, 2002). Dette tillader, at netop den særlige genekspression, som danner baggrund for embryonal- og fosterudviklingen, fremmes. Det er ligeledes vist, at embryoner klonet ved kernetransplantation fra somatiske celler ikke udviser samme grad af de-methylering, som normalt befrugtede embryoner. Dette betyder, at den genekspression, som er nødvendig for normal udvikling af i særdeleshed placenta, ikke forløber normalt.

De såkaldt imprintede gener, hvor kun den paternelle eller maternelle allel eksprimeres under embryonaludviklingen, udgør formentligt et særligt problem i denne forbindelse (Young et al., 2001). De imprintede geners ekspression styres ligeledes i vid udstrækning af methylering, som etableres i gameterne efter et kønsspecifikt mønster. Denne imprinting mistes som oftest i løbet af embryonal- og fosterudviklingen, og findes derfor ikke i somatiske celler.Ved kloning fra somatiske celler grundlægges udviklingen således fra et genom, som ikke er imprintet, og det må formodes, at cytoplasten kun i ringe udstrækning er i stand til at etablere det kønsspecifikke imprint, som er nødvendigt for den rette genekspression.

Perspektiver af kloning fra somatiske celler

Det som er med til at gøre kloning fra somatiske celler så fascinerende er, at det på den ene side er forbundet med en særdeles kompliceret biologi, som umiddelbart sætter en rækker grænser for hvor langt træerne vokser ind i himmelen, og på den anden side rummer uanede perspektiver, som meget vel kan revolutionere de fleste afkroge af den medicinske verden. Når fænomenet kloning skal perspektiveres skelnes oftest mellem reproduktiv kloning og terapeutisk kloning. Ved reproduktiv kloning resulterer processen i fødslen af afkom efter overførsel af de rekonstruerede embryoner til rugemødre. Ved terapeutisk kloning resulterer processen i tilvirkning af rekonstruerede embryoner, som dyrkes in vitro i en til to uger, hvorefter der kan høstes stamceller til medicinsk brug fra dem. I sidste instans kan den terapeutiske kloning åbne muligheder for transdifferentiering som nævnt i indledningen Den terapeutiske kloning resulterer således ikke i drægtigheder og klonede individer.

Reproduktiv kloning

Brugen af reproduktiv kloning i forbindelse med husdyravl har været diskuteret meget. I bund og grund understøtter kloningens biologi kun avlsarbejdet dårligt. Konventionel avl er baseret på, at kombination af egenskaberne fra overlegne avlsdyr fra én generation skaber yderligere genetisk fremgang til næste generation. Ved kloning føres samme genom uden forbedringer videre til næste generation. Det er muligt, at kloning fra somatiske celler kan finde begrænset strategisk anvendelse i avlsarbejdet, men nogen større udbredelse af kloning i denne sammenhæng kan ikke forventes.

Den reproduktive kloning har derimod vist sig overlegen i forbindelse med produktion af gensplejsede (transgene) husdyr. Kloningsprocessen er baseret på brugen af dyrkede karyoplaster, og muligheden for genetisk manipulation af cellerne før de anvendes til rekonstruktion af embryoner er nærliggende. Det har da også vist sig muligt at producerede transgene husdyr med langt større sikkerhed ved kloning. Tidligere baserede tilvirkning af transgene husdyr sig på injektion af de transgene DNA konstruktioner i zygotens forkerner, hvor de i heldigste fald integreres på tilfældige positioner i genomet. Herefter blev embryonerne dyrket og de overlevende overført til rugemødre. Denne metode resulterer hos mus i, at omkring en fjerdedel af de fødte unger er transgene. Hos de større husdyr ligger effektiviteten imidlertid helt nede på én procent eller derunder på grund af manglende integration af det injicerede transgen eller manglende ekspression deraf. Tilvirkes transgene dyr derimod ved kloning, overføres transgenet til de dyrkede karyoplaster ved transfektion, og da genet som oftest er knyttet til et markørgen, kan de celler, som det er lykkedes at gøre transgene, udvælges og anvendes som karyoplaster. Sidst men ikke mindst er det lykkedes at indsætte nye gener på specifikke lokaliteter i cellernes genom ("gene-targeting") forud for kernetransplantation (McCreath et al., 2000). Dette betyder yderligere kontrol over genernes funktion samt tillader knockout af gener (se senere).  

Transgene husdyr har en vifte af applikationer, som i første omgang mest har manifesteret sig på det biomedicinske område. Der findes på nuværende tidspunkt en lang række eksempler på transgene får, kvæg, geder og svin, som udskiller forskellige menneskelige proteiner med mælken. Der er ingen tvivl om, at denne form for "biofarming" i fremtiden vil være i stand til at levere livsvigtig medicin til behandling af en række menneskelige sygdomme. Denne kombinerede anvendelse af kloning ved kernetransplantation og transgene teknikker er ikke stødt på så store etiske hindringer som andre mulige anvendelser af transgene dyr.

En anden biomedicinsk applikationsmulighed, som har været genstand for stor omtale, er fremstillingen af transgene svin som organdonorer til xenotransplantation til mennesker. Der er endnu en række forhindringer, der skal overvindes, før brugen af svineorganer til transplantation kan realiseres. Den hyperakutte afvisning af transplanterede organer skyldes aktiveringen af det såkaldte komplementsystem, som ikke kan forebygges gennem administration af immunsuppressive lægemidler. Der er to strategier til at forebygge komplementsystemets hyperakutte afvisning af svineorganer: For det første kan indsættes humane proteiner på svinecellernes overflader, som gør dem "menneskelige", og for det andet kan særlig aggressive svineepitoper på celleoverfladen fjernes. Der er udført en række forsøg, hvor den første strategi er lykkedes i nogen udstrækning. Der er specielt fokuseret på de såkaldte "clusters of differentiation" (CD). Således er CD55 (eller Decay Accellerating Factor, DAF), CD46 (Membrane Cofactor Protein, MCP) og CD59 velkendte regulatorer af komplementsystemet. Der er tilvirket svin, som er transgene for henholdsvis DAF og CD59, og primater, som fik hjerter fra disse svin transplanteret, kunne overleve i flere måneder. Til sammenligning afstødtes hjerter fra ikke-transgene svin transplanteret til primater hyperakut i løbet af få minutter.

Med hensyn til den anden strategi, at fjerne særlig aggressive epitoper på svinecellerne, er der særlig fokus på de såkaldte 1,3-b-gal-epitoper. Disse udløser ligeledes den akutte afstødning af svineorganer. For at fjerne disse epitoper skal imidlertid foretages knock-out af det gen, som er ansvarlig for etableringen af epitoperne på plasmamembranen, nemlig genet for enzymet galactosyltranferase. Det har længe været muligt at tilvirke knockout-mus. Det lykkedes imidlertid først i slutningen af 2002 producere svin, hvor galactosyltransferase genet er knockout'et (Lai et al., 2002). 

Endelig skal det nævnes, at der har været en del bekymring for at retrovirussekvenser, som findes i svinegenomet, kan overføres fra et transplanteret svineorgan til menneskeceller og hermed transformeres i patogen retning. Denne risiko er svær at vurdere, og fra amerikansk side hævdes det, at der nu er fremavlet svin, fra hvilke virussekvenser ikke kan spredes. Alt i alt har perspektiverne om xenotransplantation af svineorganer været genstand for betydeligt alvorligere etiske bekymringer, end hvad angår de medicinproducerende transgene dyr. Det er således usikkert, om transplantation af svineorganer har nogen fremtid for sig. Måske kunne man forestille sig kortere tids brug af organer som f.eks. levere perfunderet udenfor kroppen til at opretholde livsfunktioner i en kritisk periode. En sidste mulig biomedicinsk applikation af transgene husdyr er tilvirkning af sygdomsmodeller, som tillader studier af menneskelige sygdomme.

Til slut skal muligheden for anvendelse af transgene husdyr i den agroindustrielle produktion blot nævnes. De transgene teknikker tillader modifikationer af f.eks. mælkesammensætning og kødfylde, men der er ikke nogen tvivl om, at den slags produkter på nuværende tidspunkt ikke vil blive accepteret af mange forbrugere.

Terapeutisk kloning

Mange sygdomme som f.eks. Parkinsons, Alzheimers, diabetes, kroniske ledlidelser, leverbetændelse og blodpropper skyldes eller forårsager irreversibelt tab af celler. Den terapeutiske kloning tager sigte på fremstilling af celler, som kan anvendes som reservedele til mennesker. Den grundlæggende tanke er, at der fra en given patient kan udtages somatiske celler, som kan anvendes til kloning ved kernetransplantation (figur 2). De rekonstruerede embryoner dyrkes herefter én til to uger, hvorefter det er mulig at høste pluripotente stamceller fra dem. Disse stamceller rummer muligheden for differentiering til alle kroppens celletyper. De differentierede celler kan siden føres tilbage til patienten, med hvem de er fuldt forenelige, da transplantationen er autolog, til erstatning af defekte celler.

Skematisk fremstilling af princippet i terapeutisk kloning
Figur 2. Skematisk fremstilling af princippet i terapeutisk kloning. Celler udtages fra en patient og etableres i cellekultur, hvorfra karyoplaster til kloning ved kernetransplantation udtages. Fra det rekonstruerede embryo kan efter én til to ugers udvikling høstes pluripotente stamceller, som siden kan differentieres til ønskede reserveceller, som kan transplanteres tilbage til patienten.

For nylig er en sådan behandling lykkedes hos immundeficiente mus (Rideout et al., 2002): Der etableredes celleliner fra de immundeficiente mus, klonede embryoner re-konstrueredes fra disse celler, stamceller isoleredes fra de klonede embryoner og mutationen korrigeredes i disse stamceller, og endelig blev de korrigerede stamceller efter differentiering in vitro transplanteret til de immundeficiente mus med det resultat, at de delvist genvandt deres immunfunktion.

Det er indlysende, at disse perspektiver støder mod en række barrierer af både biologisk og etisk karakter. På det biologiske niveau er hele embryorekonstruktionen selvfølgelig underlagt samme usikkerhedsmomenter, som allerede beskrevet. Dette betyder også, at det grundlæggende set er usikkert, hvorvidt de stamceller, som produceres, er epigenetisk normale, hvilket igen kan rejse tvivl om deres videre opførsel som differentierede celler.

Et andet problem ligger i tilvejebringelse af humane oocyter til cytoplastproduktion. På grund af kloningsteknikkens lave effektivitet vil der være behov for store mængder donerede oocyter for blot at fremstille en enkelt pluripotent stamcellelinie. Som alternativ kan overvejes brugen af artsfremmede cytoplaster fra f.eks. kvæg eller svin, hvilket imidlertid vil tilføre yderligere ukendte faktorer. Således vil de tilvirkede stamcellers genom være humant, mens hovedparten af cytoplasma inkluderende mitochrondiernes genom vil være af artsfremmed oprindelse. Hvad dette betyder for de resulterende celler, er uforudsigeligt på nuværende tidspunkt.

Endelig knytter der sig en række problemstillinger til håndteringen af de stamceller, som kan høstes fra de rekonstruerede embryoner. Den første udfordring er at stimulere de pluripotente celler til at differentiere sig til ønskede celletyper. Det synes på nuværende tidspunkt indenfor rækkevidde at producere en række forskellige celletyper som f.eks. neuroner og insulinproducerende b-celler. Den næste udfordring er at styre disse cellers opførsel, når de transplanteres til den menneskelige organisme. Der kræves stadig megen forskning før det lader sig gøre at styre de transplanterede cellers lokalisering og udbredelse. Endvidere er der fremført bekymringer om hvorvidt onkogener, som kan transformere de transplanterede celler til tumorceller, vil kunne aktiveres.

Det kan ikke forbavse, at der på baggrund af ovennævnte biologiske usikkerheder, er stor etisk bekymring over den terapeutiske kloning. Det faktum at processen som beskrevet endvidere er forbundet med tilvirkning af et klonede humane embryoner, som ganske vist ikke når at udvikle sig videre end én til to uger, giver anledning til særlig bekymring, idet det betragtes som en glidebane mod reproduktiv kloning af mennesker.

Afslutningsvis skal det anføres, at kloningsbiologien på længere sigt åbner muligheder for at forstå de mekanismer, som regulerer cellers differentiering. Der findes i cytoplasten faktorer, som er i stand til at de-differentiere celler. Kan disse beskrives og styres, kan det måske på sigt blive muligt at de-differentiere og siden re-differentiere celler uden brug af cytoplaster ved såkaldt transdifferentiering. De første skridt i retning af transdifferentiering er taget, idet det er vist, at celler inkuberet under særlige forhold med ekstrakter, udvundet fra andre celletyper, tager genekspressionsmæssigt præg af den celletype, hvorfra ekstraktet er udvundet (Håkelien & Collas, 2002). Dette forskningsfelt er særdeles lovende og vil i de kommende år blive genstand for intens aktivitet for at fremme mulighederne for autolog transplantation af terapeutisk vigtige celler. 

Afslutning

Forskning i kloning rummer mange perspektiver indenfor såvel husdyrbrug som humanmedicin. I særdeleshed rummer kloningens grundlæggende biologi en mulig nøgle til at omdanne celler fra én type til en anden ved transdifferentiering. Dette fænomen er af største betydning for muligheden for at tilvirke terapeutiske cellepopulationer til autolog transplantation. 

Referencer

Baguisi A, Behboodi E, Melican DT, Pollock JS, Destrempes MM, Cammuso C, Williams JL, Nims SD, Porter CA, Midura P, Palacios MJ, Ayres SL, Denniston RS, Hayes ML, Ziomek CA, Meade HM, Godke RA, Gavin WG, Overstrom EW, Echelard Y. Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nat Biotechnol 1999; 17: 456-61.

Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-6.

Chesne P, Adenot PG, Viglietta C, Baratte M, Boulanger L, Renard JP. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat Biotechnol 2002; 20: 366-9.

Cibelli JB, JB, Stice SL, Gloueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, Ponce de Leon FA, Robl JM. Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem-like cells. Nat Biotechnol 1998; 16: 642-6.

De Sousa PA, King T, Harkness L, Young LE, Walker SK, Wilmut I. Evaluation of gestational deficiencies in cloned sheep fetuses and placentae. Biol Reprod 2001; 65: 23-30.

Fenger M, Vaag AA. Epigenetik: DNA-metylering. Videnskab og Praksis 1999; 3823-7.

Heyman Y, Chavatte-Palmer P, DeBourhis D, Camous S, Vignon X, Renard JP. Frequency and occurrence of late-gestation losses from cattle cloned embryos. Biol Reprod 2002; 66: 6-13.

Hill JR, Burghard RC, Jones K, Long C, Looney C, Shin T, Spencer T, Thompson J, Winger Q, Westhusin ME. Evidence for placental abnormality as a major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses. Biol Reprod 2000; 63: 1787-94.

Håkelien A-M,  Collas P. Novel approaches to transdifferentiation. Cloning and Stem Cells 2002; 4:379-387.

Lai L, Kolber-Simonds D, Park KW, Cheong HT, Greenstein JL, Im GS, Samuel M, Bonk A, Rieke A, Day BN, Murphy CN, Carter DB, Hawley RJ, Prather RS. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science 2002; 295: 1089-92.

Mann M, Bartolomei MS. Epigenetic reprogramming in the mammalian embryo: struggle of the clones. Genome Biol  2002; 3: 1003.1-4.

McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KHS, Colman A, Schnieke AE, Kind AJ. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature 2000; 405: 1066-9.

Poleajeva IA, Chen SH, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares DL, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.

Rideout WM 3rd, Hoechedlinger K, Kyba M, Daley GQ, Jaenisch R. Correction of a genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy. Cell 2002; 109: 17-27.

Shin  T, Kraemer D, Pryor J, Liu L, Rugila J, Howe L, Buck S, Murphy K, Lyons L, Westhusin M. A cat cloned by nuclear transplantation. Nature 2002; 415: 859.

Young LE, Fernandes K, McEvoy TG, Butterwith SC, Gutierrez CG, Carolan C, Broadbent PJ, Robinson JJ, Wilmut I, Sinclair KD. Epienetic change in IGF2R is associated with fetal overgrowth after sheep embryo culture. Nature Gen  2001; 27: 153-4.

Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394: 369-74.

Willadsen SM. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 1986; 320: 63-5.

Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385: 810-3.