Siden sidst: Bugnende efterårshøst

Publiceret Oktober 2002

Siden sidst dækker denne gang perioden fra ca. 1. juli til 1. oktober. Det har været en ganske frugtbar høst med otte high-profile artikler. Vi har imidlertid ændret formatet af Siden sidst en smule, så der nu kun bliver 1-2 direkte omtaler, mens resten af artiklerne bliver givet i en liste bagest i indslaget. Denne gang står den således på RNA reguleret genekspression i E. coli samt Siden sidst-debut til biofysikken med et proteinfoldningsarbejde.

Antisense-regulering af translationsinitiering i E. coli.

Spot 42 RNA mediates discoordinate expression of the E. coli galactose operon.

Genes & Development 16 (2002): 1696-1706.
T Møller, T Franch, C Udesen, K Gerdes, P Valentin-Hansen. Syddansk Universitet, Odense.

Med identifikationen af små dobbeltstrengede RNA molekyler (siRNA) som nøglekomponenter i RNA interferens/Post-Transcriptional Gene Silencing samt isoleringen af et stort antal endogene mikro RNA species (miRNA) med afgørende roller i specielt vævsdifferentiation, er RNA-medieret regulering af genekspression i løbet af ganske kort tid blevet et af molekylærbiologiens hotteste felter. Mens mi/siRNA kontrolapparatet ikke er til stede i prokaryoter, lader det dog til at princippet om styring af genekspression ved næsten-komplementære RNA molekyler også er at finde her. Dette arbejde giver en særdeles nydelig karakterisering af en sådan antisense kontrolmekanisme i E. coli.

Forfatternes system er den velstuderede  galETKM operon i E. coli, og RNA molekylet under studium er det såkaldte Spot 42 RNA (Spf). Gal operonen koder for gener involveret i galaktosemetabolisme [GalK: Galaktose kinase; GalT: UDP transferase; GalE: UDP-Glc/UDP-Gal epimerase; GalM: Glc-1-P mutase], og tidligere studier har vist, at de forskellige Gal proteiner translateres fra den polycistroniske Gal messenger med forskellig effektivitet alt efter metaboliske omstændigheder. Med galaktose som kulstofkilde er GalK:GalE forholdet således 4 gange højere end under glukose-vækst pga fald i GalK produktion fra gal messengere. Denne diskoordinerede ekspression involverer den globale transkriptionsregulator CRP (cAMP receptor protein), der i kompleks med "glukose-sult signalet" cAMP aktiverer transkription fra bl.a. operons involveret i metabolisme af alternative sukre (fx fra lac- og en af de to alternative gal-promotorer). Adenylat cyclase mutanter har således diskoordineret Gal ekspression, der lige så vel som glukose-induceret diskoordineret ekspression kan hæmmes ved tilsætning af cAMP. Samtidig vides ekspression af Spot 42 RNA at være negativt reguleret af cAMP-CRP komplekset, og da forfatterne noterer sig, at der er klare komplementære regioner mellem Spot 42 RNA og området omkring GalK translationsstart i gal messengeren, kommer de på den idé, at diskoordineret Gal ekspression kunne medieres af Spot 42 RNA ved antisense kontrol.

Første test af denne hypotese er at kigge på effekten af inducibel Spot 42-ekspression og Spot 42  knockout på Gal protein ekspression. Med pulse-chase 35S-Met mærkning ses, at syntesehastigheden af GalK protein specifikt nedsættes under Spot 42 induktion, og GalE, T, K westerns viser, at glukoseinduceret diskoordineret Gal ekspression hæmmes helt af Spot 42 knockout. En klar rolle af Spot 42 RNA i medieringen af diskoordineret Gal ekspression er således etableret, så forfatterne skynder sig videre til at teste den foreslåede antisense mekanisme.

Her går de grundigt til værks og bruger først software til at foreslå en mulig sekundær struktur af Spot 42 RNA molekylet og gør sig endda den anstrengelse at vise, at de væsentlige aspekter af deres model (placeringen af stem/loop regioner) er i god overensstemmelse med RNase probing eksperimenter. Sammenligning med Spot 42 homologer fra andre bakterier viser desuden størst tæthed af nukleotidændringer i enkeltstrengede områder og basepar kompenserende ændringer i dobbelstrengede områder. En særlig dejlig egenskab ved deres sekundære struktur er, at store dele af den galK komplementære sekvens ser ud til at ligge i tilgængelige områder af Spot 42 RNAet.

Med et gal mRNA fragment, der omfatter galK translationsinitieringsområdet bruges nu gel skift forsøg til at vise, at de to RNA molekyler rent faktisk kan binde specifikt til hinanden, og med et nydeligt RNase T2 (specifik for enkeltstrenget RNA) footprint ses, at tre korte områder i den enkeltstrengede, galK komplementære region af Spot 42 beskyttes under binding til galK mRNA fragmentet.

Hypotesen holder altså indtil videre: Den regulatoriske korrelation mellem Spot 42 og GalK er OK in vivo, og in vitro ses binding, der meget vel kunne tænkes at hæmme ribosombinding til gal messengeren. For helt at hamre hovedet på sømmet bruges et såkaldt toe-printing assay til at vise, at Spot 42-galK interaktionen rent faktisk forhindrer binding af galK til den lille ribosomale subunit. Her udnyttes at når 30S sidder bundet til mRNAet fås et stærkt stop signal i en primer extension reaktion startet nedstrøms for start kodon. Med en galT  messenger ses det klare stop signal selv i tilstedeværelse af Spot 42 RNA, mens Spot 42 RNA i overskud helt fjerner stop signalet - og derfor 30S binding - i galK reaktionen.

En interessant krølle på historien er at Odense-gruppen tidligere har vist, at det Sm-lignende protein Hfq er nødvendigt for Spot 42 funktion; sandsynligvis som mediator af RNA:RNA interaktioner (Møller et al. 2002, Mol. Cell 9:23-30; se iø Siden sidst i Biozoom nr. 2, 2002). Eukaryote Sm lignende proteiner er involveret i mRNA metabolisme (fx decapping), men mutanter i biokemisk ukarakteriserede Sm homologer, hvis fænotyper tyder på specifikke regulatoriske funktioner, antyder at en skelen til E. coli Hfq:Spot 42:galK modellen for inspiration kunne være nyttig også i eukaryote systemer.

2-state or not 2-state

Early kinetic intermediate in the folding of acyl-CoA binding protein detected by fluorescence labeling and ultrarapid mixing

PNAS 99 (2002): 9807-9812
K Teilum, K Maki, BB Kragelund, FM Poulsen, H Roder. Københavns Universitet; University of Philadelphia.

Igennem mange årtier har mekanismerne for hvorledes proteiner folder, dvs. hvordan et protein finder sin native struktur fra en udfoldet tilstand, forundret forskere. En af de dominerende ideer kom tidligt fra Levinthal, der i en grov beregning anslog hvor mange konformationer et protein med et givent antal rester kunne antage. Dette tal, der viser sig at være astronomisk, brugte han som argument for at der måtte være specifikke foldningsveje (pathways), da en tilfældig søgning i dette enorme konformationsrum umuligt kunne være kompatibelt med de observerede foldningshastigeder, ja rent faktisk ville proteiner ikke kunne folde i universets levealder. Dette argument, som sidenhen viste sig ikke at være gyldigt da foldning ikke er en tilfældig proces, blev et startskud til en række undersøgelser af proteiners foldningsveje. I særdeleshed ville man undersøge de intermediater og hastighedsbegrænsende »transition states« som et protein måtte gennemgå for at komme fra den udfoldede tilstand til den native struktur. Der blev i særdeleshed fokuseret på intermediater, dels fordi de er nemmere at studere en transition states (intermediater er lokale minima i energi langs foldningsvejen, transition states er maxima), dels fordi Levinthal argumenterede for at det var gennem disse intermediater at et protein undgik at fare vild i det enorme konformationsrum. Det var derfor en overraskelse at der tidligt i 90?erne blev fundet proteiner, hvoraf byg-proteinet CI2 var det første, der tilsyneladende foldede uden detekterbare intermediater. Denne slags proteiner, der kaldes 2-state da der kun befolkes to tilstande, den udfoldede og den native men ingen intermediære, blev sidenhen et paradigme for foldnigsstudier, da de er nemmere at studere pga. deres simple foldnings kinetik.

Et af de bedst studerede 2-state proteiner er et acyl bindende protein, ACBP, der har været studeret biofysisk med en lang række af teknikker i Poulsens gruppe. Proteinet opfylder alle de gængse, og ret strenge, kriterier for at have 2-state foldning. Det var derfor overraskende at hydrogenudvekslingseksperimenter for nogle år siden indikerede at der tidligt i foldingsprocessen blev dannet partiel struktur. Denne observation er i uoverensstemmelse med den traditionelle 2-state opførsel, der udsiger at der ikke befolkes nogen partielt foldede, stabile strukturer mellem den udfoldede og den foldede tilstand.

Et karakteristikum ved foldningen af disse små, 2-state proteiner er at de ofte folder meget hurtigt. ACBP folder f.eks. med en tidskonstant i størrelsesorden 5 ms for det hastighedsbegrænsede trin. Det er derfor særdeles vanskeligt, rent teknisk, at studere processer der foregår tidligt i foldningsvejen da disse ofte er meget hurtigere. Dette er dog lykkedes i det netop publicerede arbejde i PNAS hvor Teilum et al. viser at det er muligt at observere endnu en kinetisk fase i ACBP foldningen, hvilket viser at der er mindst tre stabile tilstande for ACBP; udover den udfoldede og den foldede er der en intermediær tilstand der dannes tidligt i foldningsprocessen. For at observere denne intermediære tilstand må Teilum et al. dog ty til et par krumspring. Dels kræves der særligt udstyr for at observere meget hurtige processer, dels kræves der en velegnet spektroskopisk probe der kan adskille de forskellige tilstande. For at overkomme første problem benyttes der en, i princippet meget simpel men i praksis ganske kompliceret, teknik kaldet continuous flow (CF). CF er en metode til hurtigt at blande to opløsninger og dermed initiere foldningsprocessen. Med det benyttede apparat kan man observere processer med tidskonstanter ned til omkring 50-100 ms. Hvis foldning af ACBP studeres med dette apparat er der indikation for en hurtig proces tidligt i foldningsprocessen. For at kunne studere denne proces i detalje kommer det andet trick, nemlig at introducere en fluorescerence gruppe (IAEDANS) på en specifik position i ACBP. IAEDANS har den egenskab at den kan indgå i fluorescens resonans energi overførsel med de to tryptophan rester i ACBP. Denne overførsel er stærkt afhængig af afstanden mellem Trp resterne og IAEDANS gruppen, hvilket giver en særdeles følsom spektroskopisk probe for konformationelle ændringer. Med kombinationen af CF teknikken og IAEDANS opmærkningen opnår Teilum et al. præcise kinetiske parametre for de kinetiske faser i ACBP foldningen. Ved at studere effekten af denaturant på de kinetiske parametre udledes der at det observerede intermediat dannes meget tidligt i foldningen; ikke kun tidsmæssigt set men også ved at det tilsynelande er meget mere ekspanderet end både den foldede form og den hastighedsbegrænsende tilstand, der dannes lige inden den foldede form.

Med disse studier af ACBP har Teilum et al. føjet ny, vigtig information til de processer der er involveret i ACBP foldningen. Men derudover har studierne også bragt et nyt spørgsmål på banen: hvad er kriterierne for at man kan sige at et protein folder med 2-state kinetik? Tilsynelande, udfra de gængse kriterier, folder ACBP som et sådant. Først med to styk krumspring, CF og IAEDANS mærkning, kan den hurtige fase observeres. Der åbnes derfor også mulighed for at foldningen af andre proteiner, der hidtil er blevet kategoriseret som 2-state, måske også involverer dannelsen af intermediater. Måske er det simple 2-state billede en hypotetisk abstraktion, der viser sig, hvis man leder godt nok, at være meget sjædent observeret.

Øvrige artikler

Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry.

Nature 419 (2002): 537-542.
E Lasonder, Y Ishihama, JS Andersen, AMW Vermunt, A Paln, RW Sauerwein, WMC Eling, N Hall, AP Waters,HG Stunnenberg, M Mann. Syddansk Universitet, Odense; University of Nijmegen, NL; University of Leiden, NL; Wellcome Trust Sanger Institute, UK.

A functional and structural basis for TCR cross-reactivity in multiple sclerosis.

Nature Immunology 3 (2002): 940-943.
HLE Lang, H Jacobsen, S Ikemizu, C Andersson, K Harlos, L madsen, P Hjorth, L Søndergaard, A Svejgaard, K Wucherpfennig, DI Stuart, JI Bell, EY Jones, L Fugger. Skejby Sygehus, Aarhus; Aarhus Universitet; Rigshospitalet, København; Københavns Universitet; University of Oxford, UK; John Radcliffe Hospital, UK; Dana-Farber Cancer Institute, USA.

A phosphoserine/threonine-binding pocket in AGC kinases and PDK1 mediates activation by hydrophobic motif phosphorylation.

EMBO Journal 21 (2002): 5396-5407.
M Frödin, TL Antal, BA Dümmler, CJ Jensen, M Deak, S Gammeltoft, RM Biondi. Glostrup Hospital; University of Dundee, UK.

Hereditary spastic paraplegia SPG13 is associated with a mutation in the gene encoding mitochondrail chaperonin Hsp60.

American Journal of Human Genetics 70 (2002): 1328-1332.
JJ Hansen, A Dürr, I Cournau-Rebeix, C Georgopoulos, D Ang, MN Nielsen, C-S Davoine, A Brice, B Fontaine, N Gregersen, P Bross. Skejby Sygehus, Aarhus; Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, FR; Centre Medical Universitaire, Genève, Schweiz.

Molecular cloning and functional expression of the first insect FMRFamide receptor.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002): 12073-12078.
G Cazzamali, CJP Grimmelikhuijzen. Københavns Universitet.

Delayed onset of brain edema and mislocalization of aquaporin-4 in dystrophin-null transgenic mice.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002): 13131-13136.
Z Vajda, M Pedersen, E-M Füchtbauer, K Wertz, H Stødkilde-Jørgensen, E Sulyok, T Dóczi, JD Neely, P Agre, J Frøkiær, S Nielsen. Aarhus Universitet; Skejby Sygehus, Aarhus; Max Planck Institute of Immunolgy, Freiburg, DE; University of Pecs, Ungarn; Johns Hopkins University, USA.