Vanilin og bioteknologi

Publiceret Oktober 2002

Vanillens historie

Vanilleorkidéen er oprindelig hjemmehørende i Sydøst Mexico, hvor den voksede som det eneste kendte sted i verden. Vanille var et eksklusivt og svært tilgængeligt krydderi, fordi man ikke kunne få planten til at bære frugt andre steder. Efter Cortez's erobring af Aztekerne i 1519 blev vanille kendt i Europa, bragt hertil af en spansk handelsrejsende. I starten af 1600-tallet introduceres vanille i Frankrig, hvor den anvendes til at mildne smagen af kaffe og tillige som indhold i chokoladedrikke.

I 1836 fandt man, at en bestemt bi, melipone bien, er ansvarlig for bestøvning af vanilleorkidéen og få år efter udvikledes en teknik, hvorved håndbestøvning blev mulig, således at vanilleorkidéen kunne dyrkes udenfor Mexico, nemlig i  Réunion og Madagasker. I 1900-tallet bliver vanilleorkidéen dyrket adskillige steder og vanille bliver og er stadig den mest populære aroma i verden. Den anvendes til mad- og drikkevarer, konfekture, som duft i parfumer og kosmetik og i farmaceutiske produkter. I dag produceres 60 procent af verdensmarkedets vanille fra sorten Vanilla Planifolia på øerne Madagasker, Réunion og Comorerne i det Indiske ocean, 30 procent leveres af Indonesien. Desuden produceres vanille på Tahiti (Vanilla Tahitensis), Bali, Guadeloupe (Vanilla pompona) og Martinique i Vestindien. Under 1 procent af verdensproduktionen stammer i dag fra Mexico.

Vækstbetingelser for vanilleorkidéen

Der kræves helt specielle vækstbetingelser for vanilleorkidéen: Beliggenhed 10-20 grader nord eller syd for ækvator og 600 m over havoverfladen, varmt og fugtigt tropisk klima med en årlig temperatur på 24-30°C, næsten ingen vind og let skrånende rig jord. Vanilleorkidéen blomstrer efter 3 års vækst og blomsterne bliver alle andre steder end i Mexico håndbestøvet på et ganske bestemt tidspunkt. 6-9 måneder efter bestøvning er bælgene gule i spidsen og klare til at blive høstet for efterfølgende modning (Fig. 1). Sker høsten for tidligt, opnås en forringet aroma kvalitet og udbytte og  kommer høsten for sent i gang, ødelægges bælgen, hvorved den kommercielle værdi forringes.

2002_4 fig_q1.jpg
Figur 1. (A) Håndbestøvning af vanilleblomst. Vanillebælge før (B) og efter (C) behandling.

Behandling af bælge

Friske bælge har ikke dannet aromakomponenter og en behandling er nødvendig for at udvikle disse. For at igangsætte processen nedsænkes bælgene i varmt vand et par minutter for at ødelægge klorofyl, afslutte modningsprocessen, bryde de indre vægge og udløse de enzymatiske reaktioner. Selve fermenteringsprocessen foregår ved, at de varme og tørrede bælge pakkes ind i tæpper et døgns tid. I denne periode tabes fugtighed og bælgene får deres karakteristiske brune farve. Den efterfølgende langsomme tørringsproces foregår ved, at bælgene spredes på tæpper i solen om dagen og indendørs om natten for at skabe så favorable temperaturer som muligt for enzymprocesserne. Bælgene bliver herved mørkere, udvikler aromaer og skrumper. Endelig tørres bælgene i flere måneder og efterfølgende vurderes bælgenes kvalitet på bønnernes længde, udseende, farve og fugtighedsindhold.

Vanille ekstraktionsprocessen foregår med en blanding af ethanol og vand efterfulgt af sedimentation, filtrering og centrifugering og endelig flere måneders modning, hvor alkoholen i ekstraktet accelererer dannelse af estere fra organiske syrer. De højere alkoholer oxideres langsomt til aldehyder, der sammen med esterne giver vanilleekstraktet dets fyldige aroma.

Ekstraktionsprocessen udføres af flere aromahuse, heriblandt Danisco. Vanille er sammensat af mere end 250 aromakomponenter, hvoraf vi har identificeret mere end 150 af disse, og det gør vanille til den mest komplekse aroma i verden. Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) udgør langt størstedelen af disse komponenter og vanillin tilskrives hvad smag og duft angår den karakteristiske vanillearoma. Vanillin udgør ca. 2% (w/w) af tørstofindholdet i planteekstraktet. Den biokemiske oprindelse af vanillin er ikke kendt i detaljer, men i den grønne bælg er vanillin tilstede som -D-glucosid. Under fermenteringsprocessen hydrolyseres glycosiderne, hvorved de frie aromaer dannes. Øvrige betydelige komponenter, som bidrager til vanillearomaen er vanillinsyre, vanillinalkohol, p-hydroxybenzoesyre og p-hydroxybenzylalkohol.

Markedssituationen

Verdensmarkedet for vanillin er ca. 15.000 tons, af hvilke under 1 % udgøres af vanille planteekstraktet. Prisen for dette produkt er ca. $2000/kg i modsætning til syntetisk fremstillet vanillin, som sælges for ca. $10/kg. Den væsentlig højere pris for planteekstraktet skyldes den begrænsede mængde vanillebælge, som er afhængig af skiftende høstudbytte, grundet klimaet i de pågældende lande (herunder tillige det politiske og økonomiske), samt ikke mindst den arbejdskrævende håndbestøvning og efterfølgende behandling, som ovenfor beskrevet.

Syntetisk vanillin fremstilles hovedsagelig udfra udgangsmaterialerne eugenol, guaiacol eller lignin. Sidstnævnte akkumuleres som affaldsprodukt i cellulose-industrien. Alle disse kemiske processer involverer reagenser som nitrobenzen, natriumhydroxid og svovlsyre. De fleste processer udføres ved høje temperaturer og er derfor energikrævende. Syntetisk vanillin anvendes enten alene eller som supplement til planteekstraktet, men syntetisk vanillin er ofte harsk og mangler den karakteristiske sammensatte aroma fra planteekstraktet.

2002_4 fig_q2.gif
Figur 2. Potentielle substrater for produktion af biovanillin.
http://www.ifis.org/forum/Nov2000/Vanilla.html

Biovanillin

Den store prisforskel mellem planteekstraktet og det syntetiske produkt kombineret med den stigende efterspørgsel efter »naturlige« aromaer gør, at det er attraktivt at udvikle produktionsprocesser for vanillin baseret på biokonversion, som opfylder gældende regler for naturlig. Der er en hurtig udvikling indenfor dette område, hvor processer baseret på kultiverede planteceller fra vanilleorkidéen eller plantevævskulturer, prokaryote eller eukaryote mikroorganismer eller isolerede enzymer som biokatalysatorer beskrives i litteraturen. Der er adskillige gode oversigtsartikler, der omhandler de forskellige processser (1,2), men i det følgende beskrives det arbejde, Danisco Innovation har udført i samarbejde med Danisco's aroma division, udviklingsafdelingen hos Danisco Sugar samt Danisco's pilotanlæg i Grindsted.

Den bioteknologiske produktion af vanillin kræver et passende substrat. De mest lovende substrater er isoeugenol, eugenol og ferulasyre (Fig 2). Eugenol findes i nellikeolie i store mængder, er let at ekstrahere og er et billigt substrat, med en pris i størrelsesordenen $5/kg. Isoeugenol er lidt dyrere og findes f.eks. i bark fra grantræer og olie fra muskatnødder. Ferulasyre er en komponent af cellevæggen i plantemateriale, f.eks. hvede-, majs, ris- og havreklid, sukkerroepulp og melasse. Ferulasyre er tilstede i esterificeret form bundet til galaktose og arabinose på pektinsidekæder og kan frigives på forskellig vis. En måde er stærk basisk hydrolyse, men en sådan behandling er ikke forenelig med en "naturlig" proces, som kræver en mikrobiologisk eller enzymatisk metode.

Ferulasyre som substrat

Hvis ferulasyre fra sukkerroepulp, en sidestrøm fra sukkerproduktionen, anvendes som startmateriale er følgende trin nødvendige at undersøge: Frigivelse af ferulasyre estere, hydrolyse af ferulasyre estere til ferulasyre, udvikling af biokatalysator, biokonversion og endelig solvent ekstraktion og oprensning af vanillin. En dampbehandling ved høje temperaturer i kort tid muliggør en ekstraktion af pektin og hemicellulose. Cellulose forbliver i uopløst form og kan fjernes. Den ekstraherede pektin indeholder ferulasyre i dets esterificerede form. En efterfølgende enzymatisk behandling med en enzymcocktail bevirker en hydrolyse til fri ferulasyre, som herefter kan ekstraheres med et passende solvent.

Pseudomonas putida omdanner ferulasyre til vanillin og videre til vanillinsyre (Fig 3) og er en mulig biokatalysator. Udfordringen ved at bruge denne organisme i en GMO-fri proces består i at mutere stammen, således at omdannelsen stopper ved vanillin. Mutanter kan selekteres efter behandling med det kemiske mutagen N-methyl-N'-nitro-N-Nitrosoguanidin for deres evne til at vokse på vanillinsyre, men ikke vanillin samt deres evne til at give en positiv reaktion i en farvereaktion med dinitrophenyl hydrazin, som derivatiserer aldehyder. En enkelt kandidat har vist sig at give et pænt resultat, når de 3 karakteristiske parametre for biokonversion vurderes: Slut vanillin koncentration, omdannelsestid og molært udbytte. Vi har i foreløbige undersøgelser fundet, at kandidat stammen kan omdanne ferulasyre til vanillin i op til 1.5 g/l indenfor ca. 24 timer med et molært udbytte på 0.4. Et sådant udbytte for den nævnte omdannelse er ikke tidligere rapporteret i litteraturen for P. putida (Rønnow og Palmqvist, upubliceret).

2002_4 fig_q3.gif
Figur 3. Metabolisme af ferulasyre i Pseudomonas. (Current opinion in Biotechnology (2000) 11:490-96)

Det er kendt, at Streptomyces setoni  kan anvendes som biokatalysator i omdannelsen af ferulasyre til vanillin (3). Vi har hentet en sådan fra ATCC stammesamlingen og i en biokonversion af ferulasyre har vi opnået en slut vanillin koncentration på ca. 9 g/l indenfor 18 timer med et molært udbytte på 0.9. Anvendes sukkerroe hydrolysat som substrat, og ikke den rene kommercielle ferulasyre, opnås 5.3 g/l på 31 timer med et molært udbytte på 0.64 (4). (Fig. 4)

2002_4 fig_q4.gif
Figur 4. Biokonversion af ferulasyre til vanillin i Streptomyces setonii. (A) Kommercielt Ferulasyre som substrat (B) Sukkerroe hydrolysat indeholdende ferulasyre som substrat.

Sukkerroe pulp indeholder ca 0.8% w/d.w. ferulasyre. I et regneeksempel produceres 50 tons vanillin. Til en sådan mængde skal der bruges omkring 20.000 tons roepulp. Regnes der med udbytter på 80-90% i de enkelte trin vil det akkumulerede udbytte være omkring 40%, hvilket betyder, at der kan hentes omkring 2.5 kg vanillin per ton pulp. Investering i et anlæg til at behandle disse mængder roepulp samt udgifter til den hydrolytiske behandling vil derfor være betydelige.

Selvom ferulasyre findes i rigelige mængder i naturen, er tilstede i sidestrømme fra forskellige produktionsprocessser, kan omdannes til vanillin i et enkelt trin med høj produktivitet og deraf følgende burde udgøre et fremragende substrat for vanillin produktion, er indvinding som rent materiale svær, hvilket er den største ulempe ved at benytte dette substrat. Med det nuværende kendskab på området er det ikke en farbar vej til en levedygtig vanillin produktion.

(Iso)-eugenol som substrat

S. setonii udmærker sig ved, i modsætning til de fleste mikroorganismer, at være særdeles tolerant overfor vanillin og derfor en fremragende biokatalysator for vanillin produktion. Det var derfor nærliggende at undersøge, hvorvidt andre substrater end ferulasyre kan anvendes. Eugenol og til dels isoeugenol er billige, kommercielt tilgængelige substrater og en dyr ekstraktionsproces er derfor ikke nødvendig. Imidlertid er disse substrater kendte antimikrobielle stoffer, men vores undersøgelser tyder på, at S. setonii kan vokse på eugenol og til dels på isoeugenol, og er i stand til at omdanne isoeugenol til vanillin, dog i små mængder. Derudover har vi fundet, at tolerancen overfor substraterne kan øges ved en tilvænning af organismen (5). En genetisk modifikation af denne stamme kombineret med optimering af fermenteringsbetingelser vil eventuelt kunne øge udbyttet tilstrækkeligt til en kommerciel vanillin proces.

De seneste år er prisen på vanille femdoblet, hvilket skyldes uvejr på Madagasker, som står for over 50 procent af verdens vanille produktion (6). Det er derfor mere end nogensinde attraktivt at finde løsninger på alternativ vanillin produktion. Biovanillin er et godt kontrollerbart alternativ: miljørigtigt i forhold til syntetisk vanillin og smagsmæssigt meget tæt på planteekstraktet, idet der under biokonversionen ikke alene dannes vanillin, men også mindre mængder af fortrinsvis den tilsvarende alkohol og syre, som bidrager til den kendte vanillearoma. I litteraturen findes der eksempler på biokonversion med henblik på at producere vanillin, og vi har anvist en proces, hvor vanillin produceres fra et overskudsprodukt. Stadigvæk er det en vurdering om økonomisk rentabilitet jvf. vore egne beregninger kombineret med en prisfastsættelse af biovanillin. Prisforskellen på syntetisk vanillin og vanille fra planteekstrakt er en faktor 200 og prisen på biovanillin vil i fremtiden finde et passende leje her imellem afhængig af markedsbehovet.

Referencer

  1. Ramachandra Rao, S. og Ravishankar, G.A. (2000) Vanilla flavour: production by conventional and biotechnological routes J Sci Food Agric 80:289-304.
  2. Preifert, H., Rabenhorst, J. og Steinbüchel, A. (2001) Biotechnological production of vanillin. Appl Microbiol Biotechnol 56:296-314.
  3. Muheim, A. og Lerch, K. (1999) Towards a high-yield bioconversion of ferulic acid to vanillin Appl Microbiol Biotechnol 51: 456-461.
  4. Gunnarsson, N. og Palmqvist, E.A. (2002) Influence of pH and carbon source on the production of vanillin from ferulic acid by Streptomyces setonii ATCC 39116 (submitted)
  5. Palmqvist E.A. and Rønnow B. (2002) Bioconversion of eugenol and iso-eugenol by Streptomyces setonii ATCC 39116. (Submitted)
  6. Danisco Magasinet (2002) nr.3