Center for Bio-Chip

Publiceret Oktober 2002

Center for BioChips - CBC - er et center uden mure under ledelse af Bioteknologisk Institut, og består i et samarbejde med 6 danske private virksomheder, DHI Vand & Miljø, samt BioCentrum DTU. De 6 virksomheder er Nunc A/S, Novo Nordisk A/S, DNA Technology A/S, Azign Bioscience A/S, Scandinavian Micro Biodevices A/S og CelTor Biosystems A/S. CBC er finansieret af en centerkontrakt under Ministeriet for Videnskab, Teknologi og Udvikling og har eksisteret siden 1. Januar 2000. CBC blev etableret med det hovedformål at udvikle forskellige biochip platforme med fokus på optimering og implementering af teknologi, samt ikke mindst at udvikle praktiske anvendelser af  biochips i en lang række forskellige miniaturiserede assays.

CBC har i de seneste 3 år opbygget en stærk kompetence indenfor udvikling, design, produktion og anvendelser af biochips i forskellige sammenhænge. Biochips er en generel betegnelse for miniaturiserede systemer/komponenter indeholdende biomolekyler eller biologisk materiale som basis for en specifik affinitetsreaktion, et cellulært respons, en katalytisk proces eller anden molekylær interaktion. I CBC har vi begrænset udviklingsarbejdet til at omfatte to forskellige platforme, dels microarraying teknologi til dispensering af biomolekyler (DNA og protein) i nanoliter skala, dels mikrofluid systemer til præcis positionering af væskestrømme under laminære flowbetingelser ved hjælp af hydrodynamisk fokusering.

 

2002_4 fig_l1a.gif
Figur 1A

Microarraying af biomolekyler

Da CBC i år 2000 startede sine aktiviteter var der kun få steder i Danmark, hvor man havde  praktiske erfaringer med DNA og protein microarraying. For at kunne producere DNA- eller protein-chips i mikroskala er der krav om adgang til robotudstyr. I CBC er der ved Bioteknologisk Institut, Nunc, Novo Nordisk og Azign Bioscience investeret i microarray robotustyr, som alle er baseret på det man kalder kontakt printing, dvs. at prøvematerialet (DNA eller protein) afsættes på slideoverfladen ved berøring med en nål. Herved afsættes ca. 1 nL prøve på overfladen, hvilket giver en spot-diameter på 50-200 µm afhængig af overfladens fysisk-kemiske egenskaber og spottingopløsningen. Denne teknologi gør det muligt at dispensere mange forskellige prøver med en varierende tæthed - Figur 1B viser f.eks. forskellige DNA prøver afsat med en tæthed på 375 spots/cm2 på en DNA-chip. Billedet af DNA-chippen er genereret efter at slideoverfladen er scannet i en microarray fluorescens scanner i en opløsning på 10x10 µm/pixel. De fleste microarray applikationer baserer sig på fluorescens assays og det er derfor ligeledes essentielt at have adgang til fluorescens-scanner udstyr. I CBC har vi arbejdet med både laser-baserede fluorescensscannere samt scannere baseret på filtrering af hvidt lys og sekventiel optagelse af billeder med et CCD-kamera.

2002_4 fig_l1b.jpg
Figur 1B

Et omfattende optimeringsarbejde blev indledningsvist gennemført i CBC m.h.p. at opnå tilfredsstillende binding af i første omgang forskellige former for DNA (PCR-produkter og oligonukleotider) på forskellige typer af slidesubstrater (dels kommercielt tilgængelige, dels nye substrater udviklet sammen med deltagende virksomhedspartnere (Nunc og Scandinavian Micro Biodevices). Senere er metoder til optimal microarraying af proteiner (antistoffer) også blevet udviklet. Resultatet af dette fundamentale optimeringsarbejde er at vi i dag har udviklet effektive metoder og procedurer til produktion og behandling af DNA- og protein-chips. Vi kan  afsætte såvel modificerede som umodificerede PCR-produkter og oligonukleotider samt antistoffer i mikrospotformat på både polymerbaserede og glasbaserede slidesubstrater.

2002_4 fig_l1c.gif
Figur 1C

Udvikling af mikrofluid baserede biochips

Virksomheden Celtor Biosystems A/S har udviklet en mikrofluid teknologi, UniqueFlowTM-teknologien, som kan anvendes til såvel molekylær-diagnostiske som cellebaserede assays.

Med UniqueFlowTM-teknologien kan molekyler eller partikler, som er opløst i en væskestrøm præcist positioneres og bringes til at interagere med immobiliserede molekyler eller celler på en chipoverflade. I den simpleste opsætning består det fluide system af 3 væskestrømme (Figur 2A). To af væskestrømmene er styrestrømme for en tredje væskestrøm som indeholder prøvestrømmen. Ved nøje at kontrollere styrestrømmenes flowhastigheder er det muligt at lokalisere prøvestrømmen så denne bringes i kontakt med den ønskede del af chip-overfladen, og derved interagerer med de molekyler eller celler som sidder i det pågældende område af chippen. 

2002_4 fig_l2a.gif
Figur 2A

Fordelen ved at anvende en mikrochipplatform til assays er dels de små prøvemængder (ganske få µL) samt de små dimensioner som i kombination med væskestrømningen sikrer op til 10.000 gange hurtigere ligand-receptor assays (antistof-antigen, DNA-DNA eller cellereceptor-ligand binding) sammenlignet med f.eks. konventionelle ELISA- eller DNA-hybridiseringsassays.

Eksempler på anvendelser af biochips udviklet i CBC

CBC havde i starten fokus på at udvikle og implementere teknologien indenfor de to definerede hovedområder, men har i den sidste halvdel af projektperioden primært arbejdet med at demonstrere anvendelsespotentialet for biochips i en række forskellige sammenhænge.

DNA-chips

Den eksplosive vækst i generering af DNA sekvensdata fra mange forskellige organismer på genomniveau og det deraf afledte naturlige ønske om f.eks. at kunne analysere mange eller alle gener fra en given organisme hurtigt og effektivt har været forudsætningen for udviklingen af DNA-chip-teknologien. Produktion af DNA-chips med en høj tæthed af specifikke DNA-spots i mikroformat har gjort det muligt at gennemføre sådanne analyser. I CBC har vi arbejdet med forskellige biologiske systemer med det fælles mål at gennemføre gen-ekspressionsanalyser på mange gener samtidig gående fra det vi kalder low-density arrays, hvor udgangpunktet er 30-200 gener, til high-density arrays, hvor op til flere tusinde geners ekspression analyseres. På BioCentrum DTU arbejdes der med DNA-chip-pioneren Affymetrix GeneChip med henblik på undersøgelser af Saccharomyces cerevisiae. På Novo Nordisk er der udviklet en DNA-chip med mere end 2000 gener fra mus til studier af diabetes relaterede problemstillinger. Azign Biosciences har ligeledes udviklet high-density array med flere tusinde gener (og ESTer) fra mus. De to sidstnævnte high-density array-typer er begge baserede på immobilisering af PCR-produkter ved kontaktprinting, hvorimod Affymetrix GeneChip formatet er baseret på immobiliserede oligonukleotider syntetiseret direkte på chippen vha. fotolitografisk maske-teknologi kendt fra computer-chip teknologien. De andre DNA-chips kan produceres in-house, og dermed tilpasses ens specifikke behov.

På Bioteknologisk Institut er der arbejdet med at udvikle genekspressionanalyser baseret på low-density arrays. I samarbejde med forskellige forskningspartnere er der etableret low-density arrays til studier af dels af cancer relateret genekspression i muse celler og tumorer, dels af virulens- og stress-mekanismer i Salmonella enterica serovar Typhimurium, og dels af forskellige signaltransduktionsmekanismer samt resistensudviklingsmekanismer i Listeria monocytogenes. Disse low-density arrays er blevet anvendt til at optimere på procedurer for genekspressionanalyser, hvor man bruger den såkaldte dobbelt-mærkningsteknik til at sammenligne genekspressionsprofiler for de udvalgte gener på DNA-chippen for to forskellige tilstande af den samme organisme. Et eksempel på en sådan analyse er afbildet i Figur 1B og 1C. En vildtype L. monocytogenes er sammenlignet med en isogen mutant (arbejdet er lavet i samarbejde med Anne Gravesen, Mejeri- og Levnedsmiddelinstituttet, KVL). Intensiteten af fluorescenssignal giver et fingerpeg om ekspressionsniveauet for det enkelte gen i mutanten og/eller vildtypen. Farven af spotfluorescensen fortæller noget om reguleringen af det enkelte gen - f.eks. i dette tilfælde indikerer en rød fluorescens, at genet enten er lukket ned i vildtypen eller er kraftigt opreguleret i mutanten, og en grøn fluorescens at genet er lukket ned i mutanten eller er opreguleret i vildtypen. Gule spots repræsenterer gener som ikke er regulerede. En hensigtsmæssig måde at afbilde resultatet af en sådan ratio-analyse er vist i scatterplottet i Figur 1C. De røde trekanter i scatterplottet repræsenterer således gener som er mere udtrykt i mutanten end vildtypen og omvendt de grønne spots repræsenterer de gener som er mest udtrykt i vildtypen. Gener som ligger omkring diagonallinien er ikke regulerede.

Mikrofluid baserede immunoassays

CelTor Biosystems og Biocentrum-DTU samt Bioteknologisk Institut har udviklet en række immunokemiske og DNA baserede assays, der alle kan udføres indenfor få sekunder under laminære flow-betingelser vha. hydrodynamisk fokusering. Som demonstrationseksempel er der i Figur 2 vist et immunoassay for bestemmelse af C-reaktivt protein (CRP). CRP er en generel markør i blodet for kritisk sundhedstilstand og indgår bl.a. som en del af immunresponset overfor mikroorganismer. I det viste eksempel er et polyklonalt CRP-antistof immobiliseret på en polymer-chip overflade. Chippen monterers i det mikrofluide system og vha. hydrodynamisk fokusering  er forskellige koncentrationer af CRP i PBS sekventielt positioneret i forskellige 50 µm lanes på chippen. For at detektere det bundne CRP-antigen fokuseres efterfølgende præcist i de samme lanes et Cy3-mærket CRP-antistof. Immunoassayet er gennemført med et flow på 4 µL/s i løbet af kun 2 sekunder pr. trin. Af den kvantitative analyse af signalintensiteten i de enkelte lanes kan det konstateres, at der under disse betingelser opnås en mætning i signal på mellem 5 og 10 mg/L CRP, og der er kun en svag grad af uspecifik binding af Cy3-anti-CRP til den lane som ikke har været eksponeret for CRP (0 mg/L).

2002_4 fig_l2b.jpg
Figur 2B

Andre biochip applikationer i CBC

Etablering og udvikling af biochip-konceptet i CBC har ikke kun været begrænset til de viste eksempler ovenfor. Udviklingen af miniaturiserede bioassays har også omfattet etablering af metoder til f.eks. at kunne arbejde med og studere levende celler (f.eks. mammale og gær) i mikrofluid systemet (CytoChipTM), design og test af 16S rRNA oligonukleotid DNA-chips til specifik identifikation af patogene mikroorganismer i drikkevand baseret på hybridisering og detektion af fluorofor-mærkede 16S rDNA konsensus-PCR-produkter (i samarbejde med DHI Vand & Miljø), og optimering og demonstration af anvendelsen af antistof microarrays i en analog dobbeltmærkningsteknik til den som anvendes ved genekspressionsanalyser, men her altså med udgangspunkt i mærkning af protein-fraktioner fremfor mRNA.

I visse applikationer har vi også bragt biochip-konceptet meget tæt på en mulig praktisk implementering i lægeklinikken eller i analyselaboratoriet. F.eks. har vi demonstreret, at det er muligt at måle på blodkomponenter i det mikrofluide system, og at det er muligt at måle på stoffers cytotoksiske effekt i det mikrofluide system ved eksponering af levende mammale celler.

2002_4 fig_l2c.jpg
Figur 2C

Det bør også nævnes at andre aktiviteter i CBC har haft fokus på fortolkning og behandling af store datamængder i form af genekspressionsdata fra mange forskellige gener under mange forskellige betingelser ved at gøre brug af nogle af de nye bioinformatiske værktøjer, som er helt essentielle for at kunne overskue og gennemskue komplekse sammenhænge. I den sammenhæng har vi bl.a. demonstreret explorative multivariate dataanalysemetoders relevans som alternativ eller supplement til de mere klassisk orienterede statistiske metoder til gruppering og analyse af komplekse datasæt.

Et større tværgående samarbejde i CBC er bl.a. i gang mellem Novo Nordisk, Azign Biosciences, BioCentrum DTU og Bioteknologisk Institut med det formål at evaluere robustheden i DNA-chip baserede genekspressionsanalyser ved at lave analysen på forskellige lokaliteter og med forskellige DNA-chip platforme dækkende spektret fra low-density arrays med 20 gener til high-density Affymetrix GeneChip arrays med flere tusinde gener.

Efter CBC

I forhold til de milepæle og mål der oprindeligt blev sat ved etableringen af Center for BioChips kan vi konstatere, at vi med stor succes har formået at leve op til disse og i vid udstrækning gennemført de planer, som blev udstukket for snart mere end 3 år siden. Men dermed er det ikke slut - man kan snarere sige at det med afslutningen af centerkontrakten først rigtig for alvor begynder. I gennem 3 år har virksomheder, universitetsinstitutioner samt ikke mindst de involverede godkendte teknologiske serviceinsistitutter (GTS) i CBC via en stor offentlig finansiering på godt 10 mio. kroner opbygget en solid kompetence indenfor udvikling og anvendelse af biochips. For de involverede GTS-institutters vedkommende handler det nu om at sikre, at de opbyggede kompetencer i form af serviceydelser og kontraktforskning markedsføres og tilbydes en bred kreds af kunder primært i Danmark omfattende private virksomheder og forskningsinstitutioner.

Bioteknologisk Institut kan i den sammenhæng tilbyde at designe og producere low-to-medium DNA-chips (<400 spots/cm2) til diverse applikationer herunder genekspressionsanalyser. Herudover tilbydes at scanne og analysere DNA-chips (såvel in-house producerede som andre kommercielt tilgængelige DNA-chips). Øvrige DNA-chip baserede applikationer som også tilbydes omfatter bl.a. chips til genotypning og mikrobiel diagnostik. UniqueFlowTM systemet er ligeledes bragt til et niveau, hvor cellebaserede assays, f.eks. hurtige brugerdefinerede toksikologiske screeningsanalyser er praktisk anvendelige.

For øvrig information om samarbejde, muligheder og services rettes henvendelse til Centerleder Kim Holmstrøm, Bioteknologisk Institut, (e-mail: kho@bioteknologisk.dk).