RNA interferens – cellebiologi i det 21. århundrede?

Publiceret Oktober 2002

Traditionelt belyses proteiners funktion gennem revers genetiske studier, hvor et givet proteins aktivitet eller udtrykkelse blokeres for derefter at iagttage den fremkomne fænotype. Dette kan opnåes via ekspression af en dominant negativ isoform, introduktion af strukturelle mutationer eller ved antistof injektioner. De genetisk baserede fremgangsmåder er pålidelige, men desværre også meget arbejdskrævende, og derfor er alternative strategier udviklet. Via antisense RNA har man forsøgt at påvirke udtrykkelsen af specifikke proteiner ved at blokere mRNA translationen, men metoden giver svingende resultater. For at kunne automatisere bestemmelsen af proteiners funktion vha. revers genetiske studier, kræves derfor en hurtig, specifik og robust fremgangsmåde til at eliminere et givet proteins ekspression.

I 1998 rapportede Andrew Fire, at dobbeltstrenget RNA (dsRNA) potent og specifikt kan nedregulerere ekspressionen af de komplementære gener i nematoden Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998). Fænomenet blev kaldt RNA interferens (RNAi), og lige siden er der arbejdet intenst for at forstå den bagvedliggende molekylære mekanisme. I dag benyttes RNAi som værkøj i hele organismer og forskellige cellelinier. Hvert enkelt gen på kromsom I og III i C. elegans er blevet supresseret og fænotypen bestemt, og i mammale cellekulturer undersøges det, hvorvidt RNAi kan benyttes i terapeutisk øjemed.

RNA interferens, en cellebiologisk revolution

I midten af 90'erne eksperimenterede Guo og Kemphues med at nedregulere genekspressionen af Par-1 i C. elegans med antisense RNA, men observerer til deres overraskelse, at kontrolforsøget med sense RNA ligeledes fører til specifik hæmning af gen udtrykkelsen (Gou og Kemphues 1995). Denne observation lignede, hvad der førhen var demonstreret i svampe, benævnt quelling, samt i planter kendt som co-suppression og senere Post-Translational Gene Silencing (PTGS). Selvom Gou og Kemphues resultater var et mysterie, blev der ikke draget paralleller til observationerne i planter og svampe.

Først i 1998 udførte Fire og Mello en række eksperimenter, som kunne forklare, hvad deres kolleger tidligere havde set. I deres antisense RNA forsøg med C. elegans opdager de, at dsRNA har kontamineret både sense og antisense RNA præparaterne, og faktisk er ansvarlig for gennedreguleringen. Efterfølgende viste de, at dsRNA nedsætter genekspressionen ca. 100 gange mere effektivt end antisense RNA, samt at injektion af dsRNA i tarmen på C. elegans ikke blot hæmmer genekspressionen i hele dyr, men også i dets første generations afkom (Fire et al., 1998). Metoden viste sig hurtigt at være brugbar mod en bred vifte af gener i C. elegans, og snart blev RNAi et værdsat værktøj i forskellige organismer såsom bananfluer (Drosophila melanogaster), zebrafisk (Danio renio), andemad (Arabidopsis thaliana), bakterier (Escherischia coli), og svampe (Neurospora crassa). RNAi effekten hos disse organismer induceres af lange dsRNA molekyler (ca 700 bp). Dette gør, at denne metode ikke direkte kan overføres til mammale celler, idet disse er udstyret med et forsvarssystem, interferon responset, som er rettet mod viralt dsRNA og transposon elementer. Responset omfatter aktivering af en dsRNA responsiv protein kinase (PKR) samt 2',5' oligoadenylat syntasen (2', 5' OAS) og udløses ved tilstedeværelsen af selv ekstremt små mængder dsRNA (over 30 bp). Aktivering af  PKR og 2', 5' OAS syntasen fører til henholdsvis inaktivering af translations initieringsfaktor eIF2a og aktivering af RNase L resulterende i global uspecifik supression af translationen, mRNA nedbrydelse  og apoptose (Stark et al., 1998).

I år 2000 blev de første mammale RNAi forsøg udført på udifferentierede embryonale stamceller fra mus (Yang et al., 2001). Inducering af RNAi med lange dsRNA molekyler i disse celler medfører ikke aktivering af interferon responset, og resulterer derfor i specifik gennedregulering. Samme forsøg blev udført i differentierede celler, hvilket førte til udløsning af  interferon responset og dermed global gensupression.

Omtrent samtidigt opdagede Zamore under en række RNAi eksperimenter i Drosophila embryo lysater, at de lange dsRNA molekyler, der benyttes til inducering af RNAi, processes til små dobbeltstrengede fragmenter på 21-23 nukleotider under progressionen af RNAi (Zamore et al., 2000). dsRNA molekyler af denne størrelse ophobes ligeledes ved RNAi induktion i C. elegans (Parrish et al., 2000) og planter (Hamilton og Baulcombe, 1999). I Tuschl's laboratorie viste man, at disse korte RNA fragmenter, kaldet små interferende RNA'er (siRNA), kan inducere RNAi i bananfluer og mammale celler, og p.g.a. deres størrelse fører de ikke til aktivering af det mammale interferon system (Elbashir et al., 2001). Derimod virker siRNA mindre potent som aktivatormolekyle for RNAi i C. elegans, planter og svampe celler (Zamore 2002).

Den molekylære mekanisme bag RNA interferens

Efter det stod klart, at lange dsRNA molekyler bliver omdannet til siRNA, blev arbejdet med at opklare de bagvedliggende molekylære mekanismer i RNAi intensiveret. Zamore fandt, at de homologe mRNA molekyler kun kløves i regionen svarende til det introducerede dsRNA, samt at dette sker med 21-23 nukleotiders mellemrum (Zamore et al., 2000). Disse og andre opdagelser udgør fundamentet for  den model af RNAi mekanismen, som er præsenteret i figur 1.

Den molekylære mekanisme bag RNA interferens.
Figur 1. Den molekylære mekanisme bag RNA interferens. I cellen spalter enzymet Dicer dsRNA til aktive siRNA molekyler, der efterfølgende indbygges i det inaktive RNA-induced Silencing Complex (RISC). I komplekset opspaltes siRNA, hvilket medfører en aktiverende konformationsændring. Det aktive RISC kompleks benytter siRNA sekvensen til specifikt at lokalisere og nedbryde de homologe mRNA molekyler.

Modellen er baseret på eksperimenter i bananfluer, men de grundlæggende træk formodes at være bevaret i mange forskellige arter. Det RNase III lignende enzym Dicer katalyserer fordøjelsen af dsRNA til siRNA molekyler, hvorefter disse indbygges i RNA-Induced Silencing Complex (RISC), som består af flere forskellige proteiner med bl.a. endonuklease og helicase aktivitet (Bernstein et al., 2001). I komplekset opsnoes siRNA dupleksen, hvilket fører til strukturelle ændringer og aktivering af RISC, som efterfølgende benytter sekvensen fra antisense siRNA strengen til specifikt at lokalisere og nedbryde de homologe target mRNA molekyler (Zamore 2002).

Design og introduktion af RNAi aktiveringsmolekyler

En række optimeringsforsøg har vist, at de mest potente siRNA molekyler er 21 nukleotider lange med 2 nt 3' overhæng, dog synes sekvensen af disse overhæng ikke at være kritisk. Grundet mRNA's sekundære strukturer er effektiviteten af gennedreguleringen også afhængig af target mRNA sekvensen, da visse regioner, p.g.a. lokal foldning, er mindre modtagelige for nedbrydning. For at kompensere for dette, designes ofte 3-4 forskellige siRNA'er rettet mod forskellige regioner af target mRNA for efterfølgende at evaluere den enkeltes effektivitet.

Som supplement til siRNA, kan små hairpin RNA (shRNA) molekyler konstrueres til at hæmme ekspressionen af specifikke gener i f.eks. mammale cellekulturer. Suppresionen kan fremtvinges ved at transfektere cellerne med exogent syntetiserede hairpin RNA'er eller via ekspression af gener kodende for shRNA in vivo, hvorved det er muligt stabilt at udtrykke shRNA og derved opnå vedvarende RNAi effekt. Sidstnævnte metode kan muligvis benyttes til fremstilling af transgene dyr samt i udviklingen af nye terapeutiske strategier.

Til dags dato har injektion og transfektion af dsRNA været de mest anvendte metoder til intracellulær levering af siRNA, dog kan RNAi også induceres ved f.eks. at fodre C. elegans med transgene bakterier, der udtrykker dsRNA, eller ved at tilsætte dsRNA direkte til vækstmediet. Hvor RNAi effekten kan nedarves i C. elegans, er nedregulering af genekspressionen transient i mammale celler, hvilket sætter restriktioner for anvendelsesmulighederne. For at overkomme denne begrænsning er der udviklet ekspressionsvektorer, som kontinuerligt udtrykker siRNA i stabilt transfekterede mammale cellelinier (figur 2).

RNA interferens i laboratoriet - klik for en større version
Figur 2.RNA interferens i laboratoriet. Metoder
til introduktion af dsRNA molekyler i
forskellige cellekulturer og organismer.
(Større version)

Fremtidige perspektiver – RNAi i terapeutisk øjemed

De potentielle muligheder, der ligger i anvendelsen af siRNA medieret gennedregulering i mammale celler, er utrolig fascinerende, men optimal udnyttelse af dette nye værktøj kræver dog en indgående forståelse af aktivatormolekylernes  sekvens og strukturelle opbygning.

Korrekt genkendelse af target er vitalt, og selv små mismatches mellem siRNA/shRNA og target mRNA resulterer i en markant reduktion i evnen til at inducere RNAi, hvorfor stabil udtrykkelse af siRNA muligvis kan benyttes til at nedregulere ekspressionen af mutante alleler af f.eks. onkogener eller tumor supressor gener uden at påvirke ekspressionen af vild-type allelen.

Anvendelsen af RNAi i humane celle linier er lidt mere end et år gammel. Der er dog allerede nu flere indikationer på, at de specifikke og højpotente siRNA har potentiale som terapeutiske lægemidler. De seneste resultater har vist, at siRNA rettet mod  HIVs target receptor, CD4, og HIV proteinerne Gag og Rev kan reducere virus infektioner i mammale cellekulturer (Novina et al., 2002). Disse eksperimenter demonstrerer, at siRNA teknologi kan benyttes til hæmning af forskellige trin i HIV's livscyklus.

Hidtil er alle mammale RNAi forsøg  udført i cellekulturer, og derfor vakte det stor opsigt, da det for nyligt lykkedes et forskerhold at inducere RNAi i mus (McCaffrey et al., 2002), hvilket er et stort skridt på vejen mod det ultimative mål; brugen af RNAi i mennesker.

De seneste RNAi-studier har taget den videnskabelige verden med storm, og i fremtiden kan denne teknik vise sig at være anvendelig til udviklingen af genspecifikke therapeutika. Indtil nu er meget blevet lært omkring denne revolutionerende teknik, og ny information publiceres næsten dagligt. Det er ikke en overdrivelse at sige, at RNAi er revolutionerende inden for funktionel genomics.

Referencer

Bernstein E., Caudy A. A., Hammond S. M. & Hannon G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step RNA interference. Nature. 409, 363-366 (2001)

Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin ., Weber K. & Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001)

Elbashir S. M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W. & Tuschl T. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysates. EMBO J. 20, 6877-6888 (2001)

Fire A., Xu S, Montgomery M. K., Kostas S. A., Driver S. E. & Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391 806-811(1998)

Gou S. & Kemphues K.J. Par-1, a gene required for establishing polarity in C. Elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrical distributed. Cell. 81, 611-620 (1995)

Hamilton A. J. & Baulcombe D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999)

McCaffrey A. P., Meuse L., Pham T.-T. T, Conklin D. S., Hannon G. J. & Kay M. A. RNA interfernce in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002)

Novina C. D., Murray M. F., Dyxhoorn D. M., Beresford P. J., Riess J., Lee S., Collman R. G., Lieberman J., Shankar P. & Sharp P. A. siRNA directed inhibition of HIV-1 infection . Nature Medicine. 8, 681-686 (2002)

Parrish S., Fleenor J., Xu S., Mello C. & Fire A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Mol. Cell. 6, 1077-1087 (2000)

Stark G. R., Kerr I. M., Williams B. R., Silverman R. H. & Schreiber R. D. How cells respond to interferons.  Annu. Rev. Biochem. 67, 227-264 (1998)

Yang S., Tutton S., Pierce E., & Yoon K. Specific Double-Stranded RNA Interference In Undifferentiated Mouse Embryonic Stem Cells. Molecular and Cellular Biology. 21, 7807-7816 (2001)

Zamore P. D. Ancient pathways programmed by small RNAs. Science. 296, 1265-1269 (2002)

Zamore P. D., Tuschl T., Sharp P.A. & Bartel D. P. RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP dependent cleavage of mRNA at 21-23 nucleotides interval. Cell. 101, 13437-13441 (2000)