Siden sidst: Ingen biokemisk agurketid

Publiceret Juli 2002

Siden sidst dækker denne gang perioden fra ca. 1. april til 1. juli, og danske forfattere har denne gang så god lyst til at give deres besyv med, at vi har måttet tage ragekniven lidt i brug for at få barberet antallet af omtaler ned til et overkommeligt antal. I alt har der været artikler i Nature Cell Biology (1), Genes&Development (1), EMBO Journal (2), Journal of Cell Biology (1), Nature Biotechnology (1) og PNAS (3). Vi derfor valgt at give den fulde liste over "SiSi-arbejder", så man også kan se inden for hvilke felter de arbejder falder, som vi ikke direkte har omtalt. Eksempelvis har vi følt os på lidt for fagligt gyngende grund til at omtale stamcellearbejdet i Genes&Development, selvom det med næsten sikkerhed vil være interessant for de fleste læsere. I sidste ende er det dog blevet et ganske appetitvækkende menukort, der bl.a. indeholder nyt om regulering af mammal chromosomdeling, og om hvordan bakterier overhovedet gør den slags!

Ny regulator af den mammale centrosom-cyklus

Deregulated human Cdc14A phosphatase disrupts centrosome separation and chromosome segregation.

Nature Cell Biology 4 (2002): 317-322.
N Mailand, C Lukas, BK Kaiser, PK Jackson, J Bartek, J Lukas, Kræftens Bekæmpelse, København; Stanford University, USA.

Vores molekylære forståelse af den mammale cellecyklus bygger i høj grad på inspiration fra de simplere modelorganismer Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pompe. Mange vigtige regulatorer er først identificeret i disse organismer for sidenhen at blive funktionelt karakteriseret i pattedyrceller; nogle gange med den konklusion at den mammale homolog varetager næsten helt den samme funktion som gærproteinet. I dette arbejde starter Mailand et al. med en sådan skelen-til-gær taktik, men her munder eksercitsen ud i en konklusion, man ikke ville have kunnet gætte sig til fra gærstudierne alene.

Udgangspunktet er phosphatasen Cdc14, som i gærsystemerne spiller roller i mitose-exit og koordinationen af selve cytokinesen. Cdc14 har to mammale homologer, Cdc14A og Cdc14B, hvis mulige roller i cellecykluskontrol ikke har været velbelyste. Forfatterne lægger ud med at studere effekten af inducibel overekspression af Cdc14A og Cdc14B, og mens deres FACS analyse ikke viser nogen synderlig effekt af Cdc14B-induktion på fordelingen af cellerne gennem cellecyklens stadier, resulterer Cdc14A-induktionen i celledød ledsaget af reduktion af celler i G2-M stadiet (dvs. celler med dobbelt kromosomsæt). Immunofluorescensmikroskopi med antisoffer mod chromatin- og tentrådsmarkører viser desuden at Cdc14A induktionen inden celledøden fører til forsinket og/eller afvigende chromosomsegregering samt et multipolært tentrådsapparat (eng: mitotic spindle). Tentrådsapparatet organiseres i centrosomerne, og med vanlig sans for oversimplificering kan man se hele mitosen som en proces hvor dattercentrosomerne vandrer mod hver sin cellepol under opsamling af et sæt kromosomer. Det multipolære tentrådsapparat i Cdc14A-overekspresserende celler kunne således pege på en kobling af Cdc14A med centrosom-funktion.

Konsistent med denne ide finder forfatterne at både endogent, epitop- og GFP-tagget Cdc14A lokaliserer til centrosomet i interfaseceller, mens det dissocierer fra centrosomerne ved indgangen til mitose. Denne centrosom-lokalisering er betinget af aktiv eksport af Cdc14A proteinet fra kernen, da både hæmning af CRM1-afhængig kerneeksport og mutation af et typisk nukleært eksportsignal (NES) i Cdc14A fører til lokalisering af Cdc14A i nukleoli. Induktion af Cdc14ANES giver ikke de mitotiske afvigelser, der observeres under overekspression af vildtype Cdc14A, og scenen er således sat til mere direkte at undersøge centrosomassocieret Cdc14A funktion.

I normale celler duplikeres centrosomet inden S-fase, men dattercentrosomerne forbliver parrede indtil mitosen. To typer forsøg gennemføres for at vise, at Cdc14A direkte kan påvirke disse trin i  centrosomcyklus.

Først induceres Cdc14A i netop frigivne S-fase synkroniserede celler. Her ser forfatterne udvikling af mitotiske celler med >2 centrosomer inden færdiggørelsen af første deling, så de tidligere observerede multipolære mitotiske celler er altså ikke bare et resultat af fejlagtigt mitose-exit, men derimod af en manglende evne til at begrænse centrosomduplikationen til en omgang per fuldendt cellecyklus i Cdc14A overekspresserende celler.

Dernæst induceres Cdc14A i stabilt S-fase standsede celler. Disse celler bryder parringen af dattercentrosomerne til trods for at de ikke er i mitosestadiet, og overekspressionsstudierne peger således på, at Cdc14A har indflydelse på både duplikation og opsplitning af centrosomerne.

Denne konklusion støttes af et elegant forsøg, hvor den relativt nye RNAi teknik (RNA interference) bruges til at nedregulere Cdc14A niveauet. I sådanne Cdc14A RNAi celler ses dobbeltkerner, manglende dattercelleseparation og, vigtigst af alt, manglende separation af dattercentrosomerne selv i "mitose"-stadiet.

Både gain-of-function, loss-of-function og lokaliseringsstudier peger således på en central rolle af Cdc14A i reguleringen af centrosom-duplikationscyklen.

Prokaryot DNA segregering

Prokarytotic DNA segregation by an actin-like filament

EMBO J 21 (2002): 3119-3127.
J Møller-Jensen, RB Jensen, J Löwe og K Gerdes, Syddansk Universitet, Odense.

Mens DNA segregering under mitotisk celledeling er ganske godt forstået i eukaryote celler mangler meget viden hos de kerneløse prokaryoter. På mange plasmider findes såkaldte par-systemer der vides vigtig for segregering. Disse par systemer består af tre hovedkomponenter som på det R1 plasmid, der studeres i dette arbejde, kaldes ParM, ParR og parC. ParR er et DNA bindende protein der binder til 10 direct repeats i parC, en cis-virkende centromer-agtig DNA region på plasmidet. ParM er en ATPase med sekvenslighed med actin men hvis funktion i DNA segregering er ukendt.

Ved hjælp af immunfluorescens mikroskopi viser forskergruppen fra Syddansk Universitet (Odense) og Cambridge at ParM danner lange actin-lignende filamenter i E. coli. I mange celler ses filamenter der strækker gennem hele cellen, men der observeres også andre morfologier. Dannelsen af ParM filamenter kræver tilstedeværelse af både ParR og parC hvilket tyder på at ParR binding til parC stimulerer og er udgangspunkt for filament-dannelse. Den heterogene morfologi af de filamenter der observes tyder på at filamentering er en dynamisk proces hvor både dannelse og nedbryding af filamenter er vigtig. I et biokemisk assay for ParM polymerisering vises det at den ATP afhængige filamentering er transient in vitro. Ved hjælp af en ikke-hydrolyserbar ATP analog vises det at ATP binding er vigtig for dannelsen af filamenter mens der kræves hydrolyse af ATP for at nedbryde filamenterne. Disse resultater underbygges af ParM mutanter uden ATPase aktivitet. Således tyder resultaterne på at den dynamiske proces af filament dannelse og nedbrydning er vigtig for ParM?s rolle i DNA segregering. Gruppen foreslår en model hvori ParM binding til ParR-parC komplekser på allerede parrede plasmider initierer filamentering. De actin-lignende filamenter sørger derefter for at plasmiderne bringes til hver sin halvdel af cellen inden den deler sig. Vi er således meget tættere på en molekylær forståelse af denne vigtige proces, også i bakterier.

Protein engineering of deoxyribonucleosid kinase

A few amino acid substitutions can convert deoxyribonucleoside kinase specificity from pyrimidines to purines

EMBO J 21 (2002): 1873-1880.
W Knecht, MPB Sandrini, K Johansson, H Eklund, B Munch-Petersen og Jure Piskur, Danmarks Tekniske Universitet;Roskilde Universitetscenter; Uppsala Universitet.

Deoxyribonukleosid kinaser er vigtige enzymer i de såkaldte salvage pathways for nukleosider, idet de katalyserer phosphoryleringen af deoxyribonukleosider til de tilsvarende deoxyribonukleosid monophosphater. Udover de naturligt forekommende deoxyribonukleosider er aktiveringen af forskellige farmaceutisk relevante nucleosid-analoger vigtig. Mens nogle organismer (f.eks. pattedyr) har flere deoxyribonukleosid kinaser til at klare de forskellige naturlige puriner og pyrimidiner har andre (f.eks. D. melanogaster) en enkelt bred-specifik, multisubstrat deoxyribonukleosid kinase. De farmaceutiske anvendelser af deoxyribonukleosid kinaser ligger blandt andet som såkaldte selvmordsenzymer, det vil sige enzymer der kan omdanne en ellers uskadelig precursor-forbindelse til et for cellen giftigt stof. I kemoterapeutisk behandling af kræft og virale sygdomme med nukleosidanaloger er aktivering ved phosphorylering ofte hastighedsbegrænsende. Nucleosidanaloger der ikke kan phosphoryleres af cellens naturlige deoxyribonukleosid kinaser vil derfor være ugiftige, og hvis man kan få for eksempel kræftceller til specifikt at udtrykke en kinase, der kan omsætte analogen, vil man kunne opnå en mere specifik behandling.

I dette arbejde har forskergruppen fra DTU, RUC og Uppsala søgt at undersøge og ændre specificiteten af en deoxyribonukleosid kinase. Som udgangspunkt for deres undersøgelse bruger de den bred-specifikke deoxyribonukleosid kinase fra D. melanogaster (Dm-dNK), der kan phosphorylere alle fire naturligt forekommende deoxyribonukleosid substrater omend med præference for pyrimidiner.

Formålet med arbejdet er dels at forstå sammenhængen mellem sekvens, struktur og aktivitet således at man kan generere mutanter med ændret specificitet, men også at forstå de evolutionære aspekter af hvordan specifikke kinaser er opstået. I et tidligere arbejde er rester der er vigtige for specificitet isoleret på genetisk vis og denne viden er sidenhen kommet på strukturel grund med en krystalstruktur af Dm-dNK. Ved at mutere rester i substrat bindingslommen, dels på baggrund af krystalstrukturen men også udfra kendskab til sekvensen i mere specifikke deoxyribonukleosid kinaser, lykkes det forskerne at generere en række mutanter med ændret specificitet. Særligt en tripel-mutant af Dm-dNK har en væsentlig anderledes specificitet idet aktiviteten overfor pyrimidin substrater formindskes væsentligt uden at mindske aktiviteten overfor puriner stort. Ligeledes genererer forskergruppen mutantproteiner med ændret specificitet overfor allerede eksisterende nukleosidanaloger. Selvom det ikke lykkedes at genere enzymer der fuldstændigt specifikke overfor disse analoger er der nu bedre mulighed for at finde varianter der kan anvendes terapeutisk.

Dynamiske topoisomeraser

Dynamics of human DNA topoisomerases IIa and IIb in living cells

Journal of Cell Biology 157 (2002): 31-44.
MO Christensen, MK Larsen, HU Barthelmes, R Hock, CL Andersen, E Kjeldsen, BR Knudsen, O Westergaard, F Boege, C Mielke, Aarhus Universitet; Aarhus Kommunehospital; University of Würzburg.

Som midthalvfemserbiokemistuderende har man allerede nu kunnet smile lidt af flere af de ting, man under studiet blev sat til at lære. For eksempel skulle man være et skarn hvis ikke man vidste, at  topoisomerase II - en vigtig DNA "sammenfiltrase" - udgjorde en betydningsfuld del af det strukturelle chromosomale stillads. Ved at bruge GFP-fusioner til en grundig undersøgelse af in vivo lokaliseringen af de to topoisomerase II isoformer a og b, gør Christensen et al. imidlertid mere eller mindre op med denne anskuelse, og gør dermed sit til at bringe endnu et studiesmil frem på læberne.

Nu kunne man indvende, at der vel ikke er det helt store i at kigge på et par GFP-fusioner. Humlen er imidlertid bare, at topoisomerase II overekspression inducerer apoptose, så den slags studier ikke har været nemme at gennemføre. For at klare sig uden om denne hestepine bruger forfatterne et hjemmestrikket trick, der grænser til det luskede: De udtrykker topo II-GFP fusionerne fra en bicistronisk messenger, der også indeholder deres selektionsmarkør. Cellerne holdes nu under selektionspres, og resultatet af tricket bliver en stabil, relativt lav ekspression af GFP-fusionerne sammenlignet med det endogene topo II niveau. Vigtige parametre som in vitro og in vivo biokemisk aktivitet og positiv funktionel gærkomplementation vises at være i orden for GFP fusionerne, og forfatterne kører derfor videre til de egentlige lokaliseringsstudier. I interfasekerner finder de både topo IIa og b i nukleoplasma og særlig tydeligt i nukleoli, mens de under mitosen ser a/b forskelle. Topo IIa forbliver chromosomassocieret under mitosen, hvor topoIIb mest er i den mitotiske cytosol uden dog direkte at være chromosomekskluderet.

Rugbrøddet i artiklen er dog de mange flotte dynamikstudier. Hertil gør forfatterne brug af FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), hvor der ses på tilbagevenden af fluorescens på et bestemt sted efter blegning af GFP molekylerne på dette sted, og FLIP (fluorescence loss in photobleaching), hvor fluorescensintensiteten følges på steder væk fra det sted, der udsættes for (evt. gentagen) blegning. Da blegning er irreversibel, er en vokende FRAP-funktion og en aftagende FLIP-funktion i tiden udtryk for dynamik i den GFP-taggede population.

Først angribes interfasekerner og for både nukleolus og nukleoplasma populationer ses topoII-dynamik ved FRAP, modsat den stationære histonkontrol. Med en flot FLIP/FRAP combo vises desuden, at der både er nukleolus/nukleolus- og nukleoplasma/nukleolus-bevægelighed blandt topoisomeraserne.

Med etableringen af denne interfase topo-dynamik gås videre til at se på mitotiske chromosomer, hvor topoisomeraserne principielt set stadig kunne spille en stationær, strukturel rolle. Denne mulighed levnes dog ikke mange chancer af forfatterne, der igen med flotte FRAP og FLIP forsøg viser dynamikken i topo IIa populationen. Da FLIP forsøget - udført med enten gentagen lokal chromosom eller cytosol blegning - giver totalt fluorescenstab over hele chromosomet, konkluderes endvidere at hele topoII a populationen er dynamisk.

Den vigtige konklusion fra dette arbejde er således, at topo II næppe skal ses som en fastlåst, strukturel chromosomkomponent à la histon, men snarere som en frit bevægelig interaktionspartner til chromosomerne.

Evigt liv til knoglemarvs celler

Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintains the osteogenic potential of human bone marrow stromal cells

Nature Biotechnology 20 (2002): 592-596.
JL Simonsen, C Rosada, N Serakinci, J Justesen, K Stenderup, SIS Rattan, TG Jensen og M Kassem, Aarhus Universitetshospital og Aarhus Universitet.

Det er et velkendt fænomen at mange celletyper kun kan dyrkes i kultur i en begrænset tid. Udover at sådanne celler kun deler sig et bestemt antal gange in vitro, observerer man også ofte at cellerne mister deres funktion, for eksempel synliggjort ved ekspression af specifikke makører. Det er tidligere vist i flere forskellige celletyper at disse effekter ofte kan fjernes eller i det mindste mindskes ved at udtrykke enzymet telomerase i cellerne. I dette arbejde fra Nature Biotechnology viser forskerne fra Aarhus Universitetshospital og Aarhus Universitet at humane knoglemarvs stromaceller (hMSC) kan føjes til denne liste.

Under DNA replikation er det vigtigt at endestykkerne af kromosomerne, de såkaldte telomerer, også replikeres således at kromosomerne ikke bliver kortere for hver celledeling. På grund af det  manglende udgangspunkt for at replikere disse endestykker har cellen et enzym (telomerase) der består af en katalytisk enhed (hTERT) samt et RNA molekyle (hTR) til at varetage denne funktion. hTR fungerer som templat for hTERT?s revers transkriptase aktivitet. Forskerne viser at der ikke findes detekterbar telomerase aktivitet i hMSC. Ved at indsætte en enkelt kopi af genet for hTERT genereres celler med telomerase aktivitet hvilket forårsager at cellerne der kan dyrkes meget længere tid i kultur. De transgene celler har fordoblet sig 10 gange flere en de hMSC der er brugt som udgangspunkt. Endvidere viser forskerne at hMSC-TERT cellerne bibeholder deres evne til at differentiere sig og til at danne knogler hvis de transplanteres til mus. Endelig viser de at cellerne er genetisk og kromosomalt stabile samt at de ikke ser ud til at danne tumorer i de transplanterede mus. Resultaterne giver et godt udgangspunkt for at kunne forstå mekanismerne bag aldersrelaterede knogle-problemer og måske også mulighed for at generere nye knogler.

Andre Si-si artikler

Isolation, immortalization, and characterization of a human breast epithelial cell line with stem cell properties.

Genes&Development 16: 693-706.
T Gudjonsson, R Villadsen, HL Nielsen, L Rønnov-Jensen, MJ Bissel, OW Petersen (2002), Københavns Universitet; UC Berkeley, USA.

Inositol hexakisphosphate promotes dynamin I-mediated endocytosis.

PNAS 99: 6773-6777.
M Høy, AM Efanov, AM Bertorello, SV Zaitsev, HL Olsen, K Bokvist, B Leibiger, IB Leibiger, J Zwiller, P-O Berggren, J Gromada (2002), Novo Nordisk, Bagsværd; Karolinska Institutet, Stockholm; Lomonosov University, Moskva.

Functional requirement of aquaporin-5 in plasma membranes of sweat glands.

PNAS 99: 511-516.
LN Nejsum, T-H Kwon, UB Jensen, O Fumagalli, J Frøkiaer, CM Krane, AG Menon, LS King, PC Agre, S Nielsen (2002), Aarhus Universitet; Dongguk University, Korea; University of Cincinatti, USA; Johns Hopkins University, USA.

Energetics of glycerol conduction through aquaglyceroporin GlpF.

PNAS 99: 6731-6736.
MØ Jensen, S Park, E Tajkhorsid, K Schulten (2002)Danmarks Tekniske Universitet; University of Illinois, USA.