Siden sidst: Lidt, men godt

Publiceret April 2002

Hvor Siden sidst i den foregående periode fik lov til at debutere i Biozoom i et sandt festfyrværkeri af gode danske arbejder, er høsten i denne periode noget mere afdæmpet. Med artikler i Nature (1), Nature Genetics (1), Genes & Development (1), Molecular Cell (1) og PNAS (4), når vi dog igen op på et godt niveau. Vi har denne gang valgt at vise bredden i danske forskning ved at give eksempler indenfor mammal cellecykluskontrol, insekt endokrinologi, molekylærbiologi i planter og bakterier samt proteom-metode baseret forskning i gær.

Netværk af protein-protein interaktioner studeret "en masse"

Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry

Nature 415 (2002): 180-183.
Y Ho et al. MDS Proteomics (Odense og Toronto), Mount Sinai Hospital (Toronto) og University of Toronto

Med genom-sekventeringsprojekter, DNA array teknologi og storstilet konstruktion af mutanter i både bakterier, gær, planter og dyr har forskere haft mulighed for at undersøge mange geners funktion og ekspression på en gang. Fælles for disse teknologier er dog at de alle virker på nukleinsyre niveau. Derfor er der stor interesse i at finde nye metoder til at lave lignende stor-skala eksperimenter på protein niveau.

Et vigtigt element i at forstå cellulære funktioner i bredere forstand er at have kendskab til interaktioner mellem cellens proteiner, viden der ikke direkte er opnåelig med de ovennævnte teknikker. Storskala gær to-hybrid eksperimenter har givet et indblik i de komplicerede netværk af protein-protein interaktioner der findes i cellen, men teknikken giver rig mulighed for både falske positive og negative resultater. Som en komplementær teknik har forskerne i Odense og Toronto udviklet en metode til at studere protein-protein interaktioner direkte på protein niveau. Teknikken, som de kalder HMS-PCI (high-throughput mass spectrometric protein complex identification), er baseret på immunfældning af specifikt mærket protein og de komplekser, som proteinet måtte befinde sig i. Dernæst adskilles komplekserne ved gelelektroforese, de individuelle proteiner fordøjes med trypsin og indentificeres enten ved deres tryptiske peptiders masse alene eller ved MS/MS sekventering.

Med HMS-PCI metoden finder forskerne både velkarakteriserede og nye protein-protein interaktioner. Endvidere ser metoden ud til at give flere par af interagerende proteiner end to-hybrid forsøg. Vigtigt er det også at disse to teknikker er komplementære og baserer sig på forskellige måder at identificere interaktionerne. Protein-protein interaktioner fundet i begge typer af forsøg giver stor tillid til at denne interaktion også findes i cellen. Der er således åbnet mulighed for direkte at undersøge de store og komplicerede netværk af interaktioner der findes i cellen.

Uafhængige DNA-skade aktiverede signaleringsveje mod cellecyklus checkpoint

The DNA damage-dependent intra-S phase checkpoint is regulated by parallel pathways.

Nature Genetics 30 (2002): 290-294.
J Falck, JHJ Petrini, BR Williams, J Lukas, J Bartek. Kræftens Bekæmpelse, København.

Genomstabilitet er afgørende for cellers og organismers overlevelse. For at sikre en sådan stabilitet gør cellerne brug af DNA-overvågningsapparater, der ved aktivering som følge af detektion af DNA-skade kan forhindre fremdrift gennem cellecyklus ved hæmning af et eller flere nøgletrin. Mens en forståelse af disse stabilitetssikrende mekanismer har fundamental biologisk betydning, har den også meget åbenlyse anvendelser, da netop disse mekanismer hyppigt er sat ud af spillet i kræftceller, der derved får mulighed for aggressiv vækst trods fejlagtig replikation og kromosomdeling under celledelingerne.

Dobbeltstrengede knæk induceret af ydre påvirkniger som ioniserende stråling eller spontant dannet under DNA replikationen er et eksempel på DNA-skader, der fører til standsning DNA-syntese. En meget vigtig regulator af dette S-fase checkpoint kodes for af ATM-genet (Ataxia-Telangiectasia mutated), der er muteret i patienter med et sjældent arveligt koordinationsforstyrrelses (ataxi) / karudvidelses (telangiektasi) syndrom. ATM er en protein kinase, der aktiveres af ioniserende stråling, og denne aktivering har fysiologisk betydning, da atm celler udviser strålingsresistent DNA-syntese (radioresistant DNA synthesis, RDS). Tidligere arbejde på Kræftens Bekæmpelse (Falck et al., 2001, Nature 410:842-847) har vist, at ATM aktiverer den checkpoint signalerende protein kinase Chk2, hvis phosphorylering af Cdc25A phophatasen udløser dens nedbrydning ved ubiquitin-proteasom vejen. Cdc25A aktiverer Cdk2 ved dephosphorylering, og Cdk2 aktivitet er påkrævet for fremdrift gennem S-fase checkpointet. ATM-Chk2-Cdc25A-Cdk2 vejen fører således til S-fase stop ved inaktivering af Cdk2 gennem Cdc25A nedbrydning.

ATM har imidlertid også andre substrater med betydning for S-fase checkpointet end Chk2. Et af disse er NBS1 proteinet, der eksisterer i kompleks med MRE11, og mre11 og nbs1 celler udviser også RDS i lighed med atm celler. Fokus for dette arbejde er nu at afklare, om ATM-Chk2-Cdc25A-Cdk2 og ATM-NBS1/MRE11 vejen i virkeligheden er dele af den samme signaleringsvej eller om de udgør uafhængige elementer i signalnetværket mod S-fase checkpointet.

Forfatterne lægger ud med kvantitative DNA syntese målinger efter stråling og noterer sig, at RDS fænotypen af både mre11 og nbs1 er svagere end i atm celler. De gætter på, at det resterende ATM-afhængige RDS checkpoint respons har at gøre med Chk2-Cdc25A-Cdk2 vejen, og viser indledningsvis at dens karakteristika som Chk2 aktivering og Cdc25A nedbrydning opererer i mre11 og nbs1-baggrunde, men ikke i en atm-baggrund. Den foreløbige konklusion er således, at de to ATM-regulerede veje er uafhængige, og i hvert fald, at MRE11 og NBS1 ikke er nødvendige for aktivering af Chk2-Cdc25A-Cdk2 vejen.

For at støtte denne konklusion fokuserer forfatterne i første omgang på Cdc45-proteinet som er en del af det replikative kompleks. Associering af Cdc45 med chromatinet er afhængig af Cdk2 aktivitet, og med overbevisende chromatin-Cdc45 westerns og chromatin Cdc45-immunofældning/origo-PCR forsøg vises, at Cdc45 chromatinassocieringen brydes efter ioniserende stråling i vildtype, mre11 og nbs1 celler, men ikke i atm celler. Effekten af MRE11/NBS1 forløber altså ikke bare uden om Cdk2 hæmning, men også uafhængigt af Cdc45 chromatin associering. Mens dette forsøg i princippet bare er en fortsættelse af argumentrækken brugt tidligere ? at Chk2-Cdc25A-Cdk2 karakteristika observeres i mre11 og nbs1 baggrunde ? tilføjer det dog en nydelig mekanistisk detalje til Chk2-Cdc25A-Cdk2-vejens DNA-syntesehæmning.

Et mere rigoristisk krav til påvisning af uafhængighed af de to veje er additivitet af effekten blokade af de to veje. Da dobbeltmutant konstruktion ikke er let i humane celler, tys til en smart kombination af enkeltmutanter med dominant negative ATM og NBS1 former og overekspression af Cdc25A (giver aktiv Cdk2 og derfor en slags ?dominant negativ Cdk2? mht. RDS respons checkpoint). Først vises at man i en chk2 baggrund får en fuld atm RDS fænotype med dominant negativ NBS1, og også i en nbs1 baggrund kan en fuldstændig RDS fænotype opnås ved Cdc25A overekspression. De ATM-regulerede MRE11/NBS1 og Chk2-Cdc25A-Cdk2 veje mod S-fase checkpointet er altså uafhængige.

Nyt overlevelsesgen i planter

Knockout of Arabidopsis ACCELERATED-CELL-DEATH11 encoding a sphingosine transfer protein causes activation of programmed cell death and defense.

Genes & Development 16 (2002): 490-502.
P Brodersen, M Petersen, HM Pike, B Olszak, S Skov, N Ødum, LB Jørgensen, RE Brown, J Mundy. Københavns Universitet og University of Minnesota

Programmeret celledød (PCD) er gennem 1990erne vokset til at blive et af molekylærbiologiens helt store forskningsområder. Rammen for vores forståelse af mekanismerne bag PCD eksekvering blev lagt gennem identifikation af mutanter i Caenorhabditis elegans med enten for lidt eller for meget celledød. Mens den første klasse identificerede ?dødsgenerne? Ced-3 (homolog til mammale caspaser) og Ced-4 (delvis homolog til den mammale Apaf-1), førte den anden klasse til idenfikation af ?overlevelsesgenet? Ced-9 (delvis homolog til den mammale Bcl-2 familie). I planter sakker forståelsen af PCD mekanismer imidlertid en del agterud i forhold til dyr, på trods af at den mest almindelige PCD vej i dyr ? apoptose ? i virkeligheden tager sit navn efter en PCD-type i planter (græsk: løvfald)!

Dette arbejde præsenterer identifikationen af et nyt overlevelsesgen, ACD11,gennem isolering og karakterisering af en acd11 knockout mutant. acd11 er lethal på bladrosetstadiet, og med FACS-analyse vises, at celledøden har apoptotiske karakteristika. Sådanne karakteristika observeres både under senescens (?løvfald?) og i forbindelse pathogenudløste forsvarssystemer, hvor PCD gennemføres lokalt omkring infektionsstedet samtidig med forsvarsaktivering i det såkaldte hypersensitive respons (HR). Det godtgøres, at den aktiverede PCD-vej i acd11 nok er HR-relateret, da det senescenshæmmende plantehormon cytokinin ikke influerer på PCD-eksekveringen, og da HR-typiske cellevægsændringer og genekspression, men ikke senescens-typisk genekspression detekteres i acd11.

PCD og forsvarssignalering er i øjeblikket dårligt defineret i planter. Salicylsyre (SA), jasmonsyre (JA) og ethylen (ET) er alle inde i billedet som vigtige mediatorer, der enten kan virke synergistisk eller antagonistisk på hinanden.  Med mutanter deficiente i hhv. SA-ophobning, ET- og JA-signaltransduktion vises, at SA er påkrævet for PCD-eksekvering, idet acd11 fuldstændigt suppresseres af SA-deficiens, mens PCD gennemføres uafhængigt af intakt JA og ET-signalering. Den SA-afhængige vej involverer desuden de kendte regulatorer PAD4 og EDS1, og der argumenteres for en rolle af PAD4 og specielt EDS1 i kontrol af flere pro-apoptotiske signaler end bare SA, da acd11 pad4 og acd11 eds1 dobbeltmutanter i modsætning til SA-deficient acd11 ikke reverterer fuldstændigt ved behandling med en SA-analog. 

Forfatterne bruger nu microarray hybridisering anvendt på acd11 systemet til at udvide det begrænsede sæt af differentielt regulerede gener associeret med PCD og forsvarsaktivering. I det relativt snævre gensæt ses næsten komplette mønstre af tidligere kendte differentielt regulerede gener, og der observeres adskillige nye kandidater med sandsynlige roller i aktiveringen og/eller gennemførslen af døds- og forsvarsprogrammet.

I arbejdets hoveddel isoleres ACD11 genet. ACD11 har homologer i alle sekventerede flercellede organismer, men ikke i de to sekventerede encellede gærarter. Ingen af disse homologer er velkarakteriserede, men en fjern mammal homolog har dog glycosphingolipid transport aktivitet i vitro. Tre strukturelt forskellige sphingolipider, galactosylceramid, ceramid og sphingosin testes for ACD11 transport in vitro, og aktivitet detekteres udelukkende mod sphingosin. ACD11 proteinet etablerer således en kobling til sphingolipid signalering/metabolisme ? en interessant observation da sphingolipid species som sphingosin, ceramid og sphingomyelin lader til at spille helt afgørende roller i balancen mellem apoptose og proliferering i dyr. 

Ny forståelse af RNA reguleret genekspression

Hfq: A bacterial Sm-like protein that mediates RNA-RNA interaction

Molecular Cell 9 (2002): 23-30.
T Møller, T Franch, P Højrup, DR Keene, HP Bächinger, RG Brennan, P Valentin-Hansen. Syddansk Universitet-Odense og Oregon Health Sciences University

Det klassiske billede af regulering af genekspression involverer ofte en eller flere  trans proteinfaktorer, der binder til specifikke DNA sekvenser og fungerer som aktivatorer eller inhibitorer af transkription. Det har dog vist sig at ikke alle geners ekspression er reguleret på den måde. Et eksempel i E. coli er den alternative sigma-faktor s hvis ekspression blandt andet er reguleret af et utranslateret RNA molekyle kaldet OxyS. Mange eksempler på RNA medieret regulering er kendt, og meget tyder på at direkte interaktion med target mRNA er en generel mekanisme for eksempel gennem en anti-sense strategi. Et bakterielt protein ved navn Hfq vides at være involveret i denne type regulering. Mutanter i Hfq giver pleiotrope fænotyper hvilket tyder på at Hfq kunne være involveret generelt i ekspressionsregulering. Forskergruppen ved Syddansk Universitet i Odense har nu kommet med en mulig molekylær mekanisme hvormed Hfq virker.

Under studier af E. coli Spot 42 RNA, der er involveret i reguleringen af galaktose operon, opdagede forskergruppen at hvis Hfq proteinet manglede blev Spot 42 RNAet nedbrudt. Da Hfq har delvis sekvenslighed med eukaryote proteiner kaldet Sm, der vides at interagere direkte med RNA, var det oplagt at undersøge om noget lignende var tilfældet for Hfq. Ved hjælp af immunfældning- og gelskift-eksperimenter viste de at Hfq interagerer direkte med Spot 42 RNA, og bindingen blev endvidere undersøgt ved footprinting. Elektronmikroskopi og massespektrometri viste at Hfq danner ringformede homo-hexamerer, hvilket igen tyder på en lighed med Sm proteiner, der også danner ringstrukturer. Det vigtigste resultat er at Hfq ikke bare har en indirekte effekt ved at binde til Spot 42, men er direkte involveret i dannelsen af komplekset mellem Spot 42 og dets target mRNA. Et lignende resultat opnås for et andet par af RNA molekyler i en anden artikel i samme nummer af Molecular Cell. Meget tyder således på at Hfq's funktion involverer katalysen af RNA-RNA duplexer mellem regulator og mRNA. Mekanismen for denne funktion er endnu ukendt, men forskerne foreslår at Hfq?s funktion er at sørge for bringe de to RNA molekyler sammen således at de, på trods af deres ikke-perfekte sekvensparing, kan danne kompleks. Således tyder meget på at der er kommet hul på endnu en ikke-klassisk mekanisme for regulering af gen-ekspression.

Kloning af vigtig receptor i insekter

Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors

Proc Natl Acad Sci USA 99 (2002): 3446-3451.
F Staubli, TJD Jørgensen, G Cazzamali, M Williamson, C Lenz, L Søndergaard, P Roepstorff, CJP Grimmelikhuijzen. Københavns Universitet og Syddansk Universitet-Odense.

G-protein koblede receptorer er en stor og vigtig klasse af proteiner. Disse receptorer er centrale i en lang række fysiologiske funktioner og udgør endvidere mål for mange lægemidler. Forskergruppen ved Københavns Universitet har tidligere klonet en receptor i bananfluer med sekvenslighed med  gonatrodopin-releasing-hormone receptorer i hvirveldyr. I dette arbejde  var målet at finde peptid-ligander for denne nye receptor. Til dette formål benyttede de en biokemisk strategi hvor celleekstrakter fraktioneredes gentagne gange, og fraktionernes evne til at stimulere receptoren blev undersøgt ved et cellebaseret assay. Efter syv omgange af HPLC fraktionering opnåedes et homogent produkt, der sekventeredes massespektrometrisk. Sekvensen viser at der er tale om et tidligere karakteriseret okta-peptid hormon hørende til klassen AKH (adipokinetic hormone). AKH udgør en stor familie af peptid hormoner i insekter. De er involveret i mobilisering af sukker og fedt under høj aktivitet, men hidtil har ingen AKH receptor været kendt. Ved hjælp af sekvensen for den ny-fundne AKH receptor i D. melanogaster kloner forskerne en lignende receptor i silkeormen B. mori, en anden insekt model-organisme. Denne receptor stimuleres også af AKH. Disse resultater viser, at der nu er åbnet for muligheden for kloningen af mange insekt AKH receptorer og undersøgelser af deres aktiviteter og ligand specificiteter. Sammenligning med andre peptid hormon receptorer i for eksempel hvirveldyr vil også give yderligere forståelse af de molekylære mekanismer i insekters endokrinologi.