Kompetencecenter i Århus for genetisk modificerede mus

Publiceret April 2002

Ideen om at lave en facilitet til produktion af transgene mus var ikke ny. I det sidste tiår har undertegnede produceret transgene mus på Institut for Molekylær og Strukturel Biologi (IMSB) i Århus ved injektion af DNA i befrugtede museæg. Det nye i 1998 var dels rygterne om et nyt bioteknologiprogram til oprettelse af kompetencecentre og dels det, at en ny medarbejder, Ernst-Martin Füchtbauer, var blevet ansat på IMSB indenfor molekylær genetik og development. Han er uddannet klassisk i embryologi, benytter moderne molekylær metoder og dyrker embryonale stamceller  (ES-celler) fra mus. Derigennem var den anden gængse metode til fremstilling af genetisk modificerede mus (gene targeting) inden for rækkevide på institutet.

Den videre historie omkring bioteknologiprogrammet fra 1998 er kendt af mange. Det egentlige opslag kom til at dreje sig om oprettelse af et eller få store bioteknologiske instrumentcentre. Denne formulering blev dog senere opblødt, således at beskrivelse af kompetencer i mindre forskergrupper også kunne indsendes. Vi besluttede derfor at søge på basis af vor forskning og kompetence med genetisk modificerede mus og at inddrage vore to centrale samarbejdspartnere, som benytter genetisk modificerede mus i frontlinieforskning: professor, overlæge, dr. med. Lars Fugger, som driver grundlæggende forskning i menneskets autoimmune sygdomme på Skejby Sygehus, Århus, og forskningschef Ole D. Madsen som var leder af den basale forskning i pankreas udvikling på Hagedorn Research Institute, Gentofte.

Ansøgningen blev indsendt af Lars Fugger og blev godt modtaget af det internationale review panel. Bevillingen var en realitet i juni 2000, som et projekt under DABIC, Danmarks Bioteknologiske Instrumentcenter. Bevillingen dækker to aktiviteter som er tæt forbundet. Den første er at drive grundforskning på basis af genetisk modificerede mus indenfor: dissemineret sklerose, diabetes, leukæmi og foster udvikling. Den anden er at drive en service- og kompetence-funktion med produktion af genetisk modificerede mus dels for centerets medarbejdere, og dels som det nye også for andre danske forskningsgrupper. Mange biomedicinske og bioteknologiske projekter kan have store fordele ved at brug genetisk modificerede mus. Ofte vil en gruppe, der arbejder med et interessant gen/protein dog kun med års mellemrum ønske en ny genetisk modificeret musestamme, fordi analysen af fænotypen er tidsrøvende. Grupperne vil derfor have vanskeligt ved internt at opretholde kompetencen til at producere genetisk modificered mus, og endnu sværere ved at følge med udviklingen på feltet. Der er nu åbnet mulighed for, at disse grupper i stedet kan benytte kompetencen og servicen i centeret i Århus til at få produceret nye genetisk modificerede mus. Læs mere om dette i slutningen af artiklen. Her følger først en beskrivelse af forskningen og udnyttelsen af transgene mus i projektets fire grupper.

Lars Fugger, Transgene mus som humaniserede modeller for autoimmune sygdomme

Lars Fugger har været pionær i udviklingen af humaniserede dyremodeller for autoimmune sygdomme. Han har benyttet standard transgen teknologi og for nylig også gene targeting. Forskningsaktiviteten er primært centreret omkring undersøgelser af den trimolekylære interaktion mellem MHC klasse II molekyler, peptid antigener og T celle receptorer.

Der har været speciel fokus på studier relateret til autoimmune sygdomme. Projekterne drejer sig om reumatoid arthritis (RA) gluten intolerence (GI) og dissemineret sklerose (DS). Specielt for DS har det været muligt, at demonstrere den postulerede signalerende funktion af det trimolekylære kompleks af menneskets proteiner, efter at disse er etableret sammen i mus ved transgen ekspression.

Der er etableret MHC klasse II "knock out" mus der mangler alle musens MHC klasse II gener. Disse deleterede mus blev lavet ved at anvende det prokaryote P1 Cre-LoxP system, som præcist kan udskære store genomiske fragmenter, hvilket i dette tilfælde var omkring 100 kb. Formålet med denne mutation er at undgå, at kæder fra musens MHC klasse II molekyler pares med kæder fra de transgenerne MHC klasse II molekyler  fra mennesket. Disse "knock out" mus bliver krydset med de etablerede transgene stammer med MHC klasse II gener for at optimere de beskrevne muse modeller.

Palle Serup, Molekylære mekanismer bag udviklingen af insulinproducerende celler

Palle Serup har overtaget ledelsen af forskningen i Afdeling for Udviklingsbiologi på Hagedorn Research Institute. Her undersøges de molekylære og cellulære mekanismer der regulerer udviklingen af bugspytkirtlen generelt, og de insulin-producerende celler i de Langerhanske øer, specielt.

Et af projekterne har til formål at definere hvilke transkriptionsfaktorer der er medvirkende til at den primitive tarm bliver regionaliseret i rostro-caudal retning, samt at identificere deres "target" gener. Et andet projekt har til formål at identificere de cellulære interaktioner der er nødvendige for at en del af den primitive tarm bliver specificeret til at udvikle sig til bygspytkirtel, samt at identificere hvilke signalmolekyler der medierer disse cellulære interaktioner.

I et tredie projekt undersøges hvordan Notch signalering kontrollerer udviklingen af specifikke celletyper, f. eks. de endokrine celler, i den føtale bugspytkirtel. Gruppen har tidligere fundet at transkriptionsfaktoren HES-1, hvis gen bliver aktiveret af Notch signalering, er nødvendig for at de endokrine celler ikke dannes for tidligt og at de dannes i de rette mængder. Det er dog sandsynligt at Notch signaleringen i bugspytkirtlen også regulerer andre processer. Der findes to Notch receptorer, Notch1 og Notch2, og to ligander, Delta-like gene-1 (Dll-1) og Jagged1 udtrykt i epitelet i den føtale bugspytkirtel. Da det cellespecifikke udtryk af disse gener ændres gennem fosterudviklingen og da Dll-1 og Jagged1 medieret signalering desuden bliver differentielt modificeret af en række glycosyltransferaser er der mulighed for en endog meget kompleks signalering via Notch receptorer i bugspytkirtlen. Udforskningen af denne kompleksitet i Notch signaleringen er afdelingens 'kerne' projekt. Målet er at udnytte den opnåede viden til at påvirke stamcellers evne til at differentiere til insulin-producerende celler.

Ernst-Martin Füchtbauer, Molekylær embryologi – genetisk kontrol af udviklingen hos hvirveldyr

Hovedinteressen ligger inden for den genetiske kontrol af udviklingen. I multicellulære organismer fordre udviklingen en meget nøje koordinering cellulær deling, vandring og differentiering. På det multicellulære niveau bliver denne koordinering båret af signalering imellem celler og væv. På enkelt celle niveau regulerer intracellulær signal transduction aktiviteten af transkriptionsfaktorer og bestemmer således cellens endelige tilstand. Enhver fejl i dette regulerende system kan forårsage ændringer i udviklingen spændende fra medfødte skavanker til udvikling af kræft.

Grundige undersøgelser er igang af transkriptionsfaktoren TWIST, som har betydning for cellulær differentiering, for undvigelse fra apoptose og måske også for vandring. Mutationer i twist genet giver medfødte deformiteter i ansigt og hoved både hos mennesker og mus. Gennem fremstilling af såvel en lacZ "knock-in" som en betinget "knock-out" allell i mus, vil det være muligt eksperimentelt at bestemme starten for defekterne og samtidig at registrere udtrykket af twist genet i det voksende foster.

Udover forskning omkring TWIST transkriptionsfaktoren, analyseres mutationer som er dannet ved hjælp af såkaldte gen-fælder (se: http//genetrap.de).Ved denne metode laves tilfældige insertionsmutationer i embryonale stamceller fra mus. Disse kan efterfølgende omdannes til mus ved at blive indsat i meget tidlige museembryoner (blastocyster). Det stadigt voksende antal af disse mutationer åbner mulighed for at lede efter gener der genetisk virker sammen med twist eller andre gener med væsentlig betydning.

J. Peter Hjorth, Modeller for leukæmi i transgene mus

Leukæmi/lymfoma  er ondartede sygdomme som skyldes genetisk ændret udtryk af onkogener og tumorsuppressor gener. Dette projekt har til formål at undersøge effekten på musens hæmatopoiese af transgent udtryk af onkogener og vævsspecifik eller induceret ødelæggelse af tumorsuppressor gener. Sådanne mus vil i mange tilfælde være prædisponeret for leukæmi/lymfoma og disse mus kunne tjene som modeller for leukæmi i mennesket.

Der er lavet stammer ved injektion i æg med muterede former for onkogenerneN-Ras og c/EBPa, og ekspressions målinger er undervejs. For at undersøge betydningen af tumorsuppressor gener ved udviklingen af myeloid leukæmi/lymfoma fremstilles mus med konditioneret "knock-out", således at gen-ødelæggelsen kun foregår i bestemte væv eller ved at inducere gen-ændringen med tetracyclin eller  lactose. Hertil benyttes DNA konstruktioner med  myeloid-specific udtryk af P1 fagens rekombinase CRE som (i myeloide celler) kan fjerne tumorsuppressor gener der er omgivet af to loxP bindingssteder. Der laves tilsvarende konstruktioner hvor CRE udtrykket kan induceres. Disse CRE udtrykkende gener etableres i mus enten ved DNA injektion i æg eller ved gen-targeting ved hjælp af ES-celler. I første omgang anskaffes Rb og Nf1 tumorsuppressor gener med loxP site installeret fra andre forskere.

Nye gener involveret i leukæmi/lymfoma søges påvist gennem tagging med retrovirus. Dette er specielt interessant i transgene musestammer som i forvejen har indsat et muteret onkogen eller tumorsuppressor gen, idet nye leukæmi/lymfoma inducerende mutationer i mange tilfælde vil have samarbejdet med den allerede indsatte mutation ved udviklingen af cancer. Da menneske- og musegener er meget homologe vil gener der samarbejder om udvikling af cancer i mus i mange tilfælde også gøre det i mennesket, og en bedre forståelse af menneskets leukæmi/lymfoma udvikling vil derfor kunne opnås gennem disse forsøg.

Dansk center for transgene mus, og projektets service del

De eksperimentelle kerneområder, som centeret tilbyder andre grupper, er de processer, hvorved "livløst" DNA fra reagensglas etableres i levende mus som kromosomalt DNA, der nedarves på normal vis. Der tilbydes to fremgangsmåder, hvoraf den simpleste er injektion i æg af en DNA konstruktion, som brugeren leverer. Efter minimum 6 uger kan det afgøres hvilke unger i founder generationen, der er transgene, ved at analysere en DNA prøve. Transgene mus sendes derefter til brugeren.

Den anden fremgangsmåde er "gene targeting" eller målrettet mutagenese. Denne process resulterer fx. i "knock out" eller "knock in" af gener. Centeret kan være behjælpelig med at fremskaffe det nødvendige genomiske DNA som BAC kloner. Selve fremstillingen af målretningskonstruktionen foretages af brugeren. Centeret egentlige service starter med transformation af ES-celler med målretningskonstruktionen og isolering af specifikt muterede ES-celle kloner. Derefter sker overførslen af disse ES-celler til blastocyster og fremavl af kimæriske mus. Der skal endnu en musegeneration (3 måneder) til, før det kan afgøres om ES-celle genomet bliver nedarvet. Processen hertil (fra transformationen af ES-cellerne) tager omkring 15 måneder. Herefter sendes musene tilbage til brugeren, eller til kontraktavl på M&B A/S.

Centerets medarbejdere tilbyder faglig hjælp og vejledning under hele forløbet. I de tilfælde, hvor centerets medarbejdere bidrager på akademisk niveau opfattes aktiviteten som et samarbejde, for så vidt angår den første artikel om musene. Brugeren betaler en del af de eksperimentelle udgifter. Alle funktioner i servicedelen har nu været i gang i et år, og står til rådighed for forskningsgrupper inden for såvel dansk akademia som industri. Kontakt kan ske enten gennem DABIC s hjemmeside www.dabic.dk , gennem dette projekts hjemmeside www.danmouse.dk eller på e-mail danmouse@danmouse.dk.