Hvad er Siden sidst?

Publiceret Januar 2002

Målet med Siden sidst er groft sagt at give et indblik i hvem der laver hvad i Danmark inden for det molekylærbiologiske og biokemiske forskningsområde. Ved at bringe eksempler på god dansk forskning publiceret inden for de ca. 3 måneder mellem to udgivelser af Biozoom  håber vi at kunne gøre det på en spændende og appetitlig måde, der måske samtidig kan give lidt fagligt input inden for områder, man normalt ikke følger tæt. I særdeleshed håber vi, at studerende på vej til at vælge speciale vil få gavn af at læse dette indslag, da det også kan bruges som en vejviser over velfungerende laboratorier med beskrivelser af deres interesseområder.

For at lette udvælgelsen af "gode danske arbejder" har vi lavet to kriterier:

Vi har for det første valgt at benytte Journal Impact Factors til at vælge en række tidsskrifter ud. Et tidsskrifts Impact Factor er et udtryk for tætheden af citationer til artikler i tidsskriftet, altså forholdet mellem citationer og antal trykte artikler. Selvom Impact Factors er kontroversielle og ofte kritiseres, mener vi at de med forsigtighed kan benyttes til at rangordne tidsskrifter. Specielt når tidsskrifter indenfor samme felt sammenlignes har Impact Factors vist sig at være gode til nemt at vurdere kvaliteten af og interessen for et givent arbejde. Vi har arbitrært valgt at fokusere på tidsskrifter med Impact Factors omkring eller over 10 og har udvalgt en række tidsskrifter, der publicerer indenfor områderne biokemi, molekylær biologi og cellebiologi. Vi har manuelt søgt i indholdsfortegnelserne i disse tidsskrifter og ledt efter "danske" artikler. For at vurdere hvilke artikler der er danske, har vores andet kriterium været at benytte forfatterlistens rækkefølge til at vurdere om hovedparten af arbejdet er udført i et dansk laboratorium. Typisk vil det betyde at første- og sidste-forfatteren arbejder i Danmark, men reglerne er ikke absolutte. Vi håber at vi med de to simple regler

(i)     artikler publiceret i relevante tidsskrifter med Impact Factor over 10

(ii)    hoveddelen af arbejdet udført i Danmark,

kan finde frem til de fleste af de bedste danske forskningsarbejder. Vi er klar over at uanset hvilke udvælgelseskriterier der måtte anvendes, vil man overse nogle artikler, specielt når man tager den manuelle søgning i betragtning.

God periode

Vurderet ud fra ovenstående kriterier udgør de sidste 3-4 måneder en meget fornem periode for dansk molekylærbiologisk forskning. Hele 14 arbejder fra danske laboratorier er udkommet i tidsskrifterne Cell (1), Science (1), Genes & Development (1), Molecular Cell (1), EMBO Journal (2), Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (PNAS, 6) og Molecular and Cellular Biology (2). Udover at være eksempler på forskning af høj kvalitet synes vi, at de seks arbejder vi har valgt at give en nærmere præsentation af giver et indtryk af spændvidden i dansk molekylærbiologisk forskning.

Mekanismer bag transkriptionsfaktor-kontrol af vævsdifferentiation i pattedyr

E2F repression by C/EBPa is required for adipogenesis and granulopoiesis in vivo.

Cell 107: 247-258.
BT Porse, TÅ Pedersen, X Xu, B Lindberg, UM Wewer, L Friis-Hansen, C Nerløv (2001).

&

Cooperation between C/EBPa TBP/TFIIB and SWI/SNF recruiting domains is required for adipocyte differentiation.

Genes & Development 15: 3208-3216
TÅ Pedersen, E Kowentz-Leutz, A Leutz, C Nerløv (2001). Rigshospitalet, København.

Molekylære mekanismer bag vævsdifferentiation i flercellede eukaryoter er et stort tema i moderne molekylærbiologi. Mens nogle grove principper som fx asymmetrisk og specifik expression af bestemte  transkriptionsfaktorer har vist sig at gå igen i vidt forskellige processer i både planter og dyr, er vi endnu langt fra at have et detaljeret molekylært kendskab til de processer, der styrer differentiation. I Claus Nerløvs laboratorium på Rigshospitalet fokuseres på den mammale leucine zipper-type transkriptionsfaktor, C/EBPa (CCAAT/Enhancer Binding Protein). C/EBPa spiller vigtige roller i mange forskellige fysiologiske processer, og mus med C/EBPa knockout udviser en stærkt pleiotrop fænotype med defekter i energimetabolisme (hæmmet gluconeogenese og glycogen syntese i leveren), differentiation af adipøst væv, granulocytdifferentiation samt evnen til at standse cellulær proliferering i visse væv. Nærmere karakterisering af C/EBPa funktion i en knockout baggrund kompliceres yderligere af, at C/EBPa nul mus dør af hypoglykæmi kort efter fødslen.

For at komme en forståelse af C/EBPa in vivo funktioner og molekylære mekanismer bag dem nærmere har forfatterne taget udgangspunkt i en forudgående karakterisering af det transaktiverende domæne af C/EBPa, der besidder i hvert fald tre adskillelige elementer, TE-I, -II, -III. Med enkeltdeletionsmutanter i hvert af TE-I, -II og -III viser de, at kun TE-I og TE-III er nødvendige for C/EBPa medieret adipocytdifferentiation i cellekultur. De undersøger dernæst den mulige korrelation mellem denne differentiationsdefekt og C/EBPa medieret væksthæmning, og i et elegant GFP/FACS baseret assay vises, at TE-I-, men ikke TE-III-deletionsalleler har mistet den væksthæmmende aktivitet. Vejene skilles nu, idet Porse et al. koncentrerer sig om TE-I funktion, mens Pedersen et al. går efter at karakterisere TE-III funktion.

Med en blanding af kvalificeret gætværk og systematisk afprøvning når Porse-holdet frem til, at væksthæmningsdefekten af TE-I nok skyldes manglende hæmning af E2F-medieret transkription, idet alle andre testede C/EBPa-alleler end TE-I deletionen kraftigt nedsætter luciferase reporterekspression fra en E2F-responderende promotor. E2F er en familie af transkriptionsfaktorer, der indgår som positive regulatorer i cellecyklus kontrolapparatet ved at fremme overgangen til S-fase, og E2F sites er fundet i promotorerne for mange gener involveret i fremdrift gennem cellecyklus.

Yderligere to cellekulturforsøg gennemføres for at støtte "defekt i adipocytdifferentiation-defekt i væksthæmning-defekt i E2F repression" korrelationen. Først konstrueres og selekteres C/EBPa punktmutanter med E2F-repressionsdefekt, og ved transfektion i kulturceller vises, at kun E2F-repressionsdeficiente punktmutanter udviser manglende adipocytdifferentiation og væksthæmning. I et snedigt gennemført eksperiment baseret på inducibel E2F-aktivitet ved fusion til et steroidreceptor hormonbindende domæne vises dernæst, at C/EBPa medieret adipocytdifferentiation kan hæmmes fuldstændigt af ektopisk ekspression af aktiv E2F.

I arbejdets hovedforsøg krydser forfatterne den vigtige barriere mellem cellekulturforsøg og kombineret biokemisk/genetisk analyse i en hel organisme. De konstruerer knockin mus af C/EBPa punktmutanter med og uden E2F-repressionsdefekt, og bruger dem til understøttelse og udvidelse af de hidtige resultater. Molekylært opnås et argument for, at E2F repressionen er en direkte C/EBPa effekt, da vildtype C/EBPa, men ikke E2F-repressionsdefeciente alleler findes associeret med E2F i kerneekstrakter. Mere afgørende for karakteriseringen af in vivo funktion finder forfatterne, at alle homozygote knockin mus er levedygtige og uden leverdefekter, mens de recessive E2F-repressionsdefekte alleler udviser stærkt reduceret dannelse af adipøst væv og afvigende adipocytdifferentiation.

Forfatternes forfølgelse af TE-I funktionen munder altså ud i den interessante konklusion, at E2F-repression er nødvendig for C/EBPa-medieret adipocytdifferentiation, og forfatternes omfattende molekylærbiologiske exercits giver os således endnu et princip, der kan vise sig at have mere almen gyldighed: Kobling af differentiationsinitierende aktivitet til hæmning af proliferering ved direkte molekylær antagonisme.

Fokus for Pedersen-holdet er TE-III, der jo også var nødvendig for adipocytdifferentiation. Med grundlag i et tidligere publiceret, lidt lusket eksperiment hvor den fænotypiske effekt af erstatning af C/EBPa med versioner af isoformen C/EBPb er blevet undersøgt, gætter de på, at TE-III virker ved at rekruttere det chromatin-omorganiserende SWI/SNF kompleks. De viser, at kun TE-III deletionsalleler mangler association med SWI/SNF komponenter i kulturceller, og at C/EBPa-medieret transkription fra kendte SWI/SNF-afhængige promotorer er kraftigt reduceret i celler der udtrykker TE-III deletionsalleler. Desuden kan adipocytdifferentiationsdefekten af TE-III deletionsmutanten reddes næsten helt ved at påføre det kendte SWI/SNF bindende domæne fra C/EBPb. Da forfatterne tilmed viser, at C/EBPa punktmutanter med ødelagt TBP/TFIIB binding udviser adipocytdifferentiationsdefekter, peger deres arbejde på at to meget fundamentale transkriptionsfaktorfunktioner er påkrævede under adipocytdifferentiationen: Rekruttering af det chromatin-omorganiserende kompleks og af det basale transkriptionsapparat; funktioner der antyder mulige forklaringer på den pleiotrope C/EBPa knockout fænotype.

Kemisk krigsførsel i planters forsvar mod insekter

Resistance to an herbivore through engineered cyanogenic glucoside synthesis.

Science 293 (2001): 1826-1828.
DB Tattersall, S Bak, PR Jones, CE Olsen, JK Nielsen, ML Hansen, PB Høj, BL Møller. Den Kongelige Veterinær- og Lanbohøjskole, København.

Dette arbejde er først og fremmest et eksempel på vellykket metabolitstyring (metabolic engineering) i planter. Forfatterne har overført Sorghum-gener, som koder for enzymer involveret i biosyntesen af den tyrosinafledte forbindelse dhurrin til den ikke-dhurrinproducerende plante,  Arabidopis. Ved denne overførsel af hele dhurrin biosyntesevejen opnås morfologisk normale og fuldt fertile Arabidopsis-planter, der syntetiserer og lagrer dhurrin i samme store mængder som Sorghum, mens kun negligble niveauer af biosyntesevejens intermediater og produkter af deres sidereaktioner detekteres.

Dhurrin tilhører den sekundære metabolit-klasse, cyanogene glucosider (CG). CG er aminosyreafledte glucosider som ved hydrolyse spaltes under dannelse af bl.a. den stærkt giftige gas hydrogencyanid (HCN; blåsyre). Da CG-producerende planter under vævsskade – fx i forbindelse med insektangreb – aktiverer CG hydrolyse med blåsyrefrigivelse til følge, har det mulige bidrag af dette system til planters eget forsvar mod insektangreb været genstand for diskussion.

Forfatterne har derfor brugt de dhurrin-producerende Arabidopsis-planter til at eftervise, om CG-lagring i sig selv kan fremme insektresistens. De har anvendt et skadevoldende insekt specialiseret i angreb på de ikke-CG-producerende korsblomster, der bl.a. omfatter Arabidopsis og raps. Da insektet således ikke kan have mødt og indstillet sig efter CG gennem evolutionen, fås et system til direkte test af eventuelt bidrag fra CG-lagring til beskyttelse mod insektskade. I dette ?rene? plante-insekt system ses stærkt reduceret skade og stærkt forøget larvedødelighed på de dhurrin-producerende planter sammenlignet med normale planter uden dhurrin-lagring.  

Med tanke på anvendelse inden for landbruget er arbejdet et eksempel på, at velovervejet metabolitstyring kan være en af vejene til modificerede afgrøder med ønskelige egenskaber som fx øget insektresistens.

Sidste trin i translationen

Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRF1.

Molecular Cell 8 (2001): 1375-1382.
B Vestergaard, LB Van, GR Andersen, J Nyborg, RH Buckingham, M Kjeldgaard.Aarhus Universitet.

I gennem de sidste par år har strukturbiologien givet os stor indsigt i de molekylære detaljer i translations-processen. Først med strukturer af en række vigtige proteiner og RNA molekyler samt deres komplekser, siden med imponerende strukturer i atomar opløsning af ribosomale subunits og hele ribosomer. Danske forskere har spillet en vigtig rolle i disse studier og ikke mindst biostrukturgruppen på Aarhus Universitet har været blandt de førende. Seneste skud på stammen er en krystal-struktur af E. coli Release Factor RF2. Release Factors er proteiner, hvis funktion er at forårsage terminering af translationen, når ribosomet når et stop codon på mRNAet. Principielt minder processen om et almindeligt elongerings-trin i translationen, hvor der i stedet for at kondenseres en aminosyre til den voksende peptidkæde skal foregå en hydrolyse, således at det færdige protein frigøres. En simpel mekanistisk model for processen har været at et tripeptid motiv, SPF, står for genkendelsen af stop codon mens at et andet tripeptid motiv, GGQ, er direkte involveret i hydrolyse.

Strukturen af RF2 viser at proteinet består af 4 domæner, hvoraf de tre sidste danner en forholdsvis kompakt struktur. Domæne 1 derimod fremstår som en udstikker fra de tre andre domæner, og dermed får proteinet en L-lignende struktur. De to vigtige tripeptid motiver SPF og GGQ er kun 23 Å fra hinanden, en afstand som forskerne anslår er alt for lav til at kunne nå fra det ribosomale decoding site, hvor stop-codon præsenteres, til peptidyl tranferase centret, hvor den hydrolytiske reaktion menes at foregå. Den simple model, der primært er baseret på biokemisk og molekylær biologisk evidens, ser derfor ud til at være forkert. Et andet interessant resultat fra strukturen er at RF2 måske er endnu et eksempel på hvad der kaldes molekylær efterligning. Strukturen minder i grove træk om den karakteristiske L-formede tRNA struktur, hvor det udstikkende domæne 1 kan overlejres anticodon armen i tRNA. Strukturen kan på samme måde som tRNA indpasses i det ribosomal A-site og nå fra decoding site til peptidyl transferase site med GGQ motivet lokaliseret nær sidstnævnte. Så mens de molekylære detaljer har vist sig at være mere komplicerede end hidtil antaget, så viser strukturen at naturen måske endnu en gang har genbrugt strukturer til at udføre beslægtede opgaver.

Spot på svovlbroer

Shedding light on disulfide bond formation: engineering a redox switch in green fluorescent protein.

EMBO Journal 20 (2001): 5853-5862.
H Østergaard, A Henriksen, FG Hansen, JR Winther. Carlsberg Laboratoriet og Danmarks Tekniske Universitet.

Et gammelt dogme inden for foldning af proteiner har været, at svovlbroer primært findes i sekretoriske, men ikke i cytosoliske proteiner, fordi cytosolen er for reducerende. I eukaryoter dannes svovlbroer primært i det endoplasmatiske reticulum, og indtil for få år siden mente man, at de her blev dannet på grund af den højere koncentration af oxideret glutathion i forhold til i cytosolen.

Dannelsen af svolvbroer er primært bestemt af to faktorer. Den ene er tilstedeværelsen af et tilstrækkeligt oxiderende redoxpotential, den anden er tilstedeværelsen af proteiner, der kan katalysere dannelsen af svovlbroer. I den sidstnævnte kategori findes familien af Protein Disulfid Isomeraser, der er oxidoreduktaser som katalyserer oxidationen af frie cysteiner til disulfider og eventuelt omlejrer forkert parrede svolvbroer. Disse proteiner er velkarakteriserede og kendes i både bakterier, archae og eukaryoter. Den anden faktor, in vivo thiol-disulfid redoxpotentialer, er langt dårligere forstået. Nogle få undersøgelser har belyst emnet enten ved hjælp af lav-molekylære, exogent tilsatte reporter molekyler eller ved isolering og analyse af proteiner med karakteristika såsom enzymatisk aktivitet, der afhænger af dannelsen af svovlbroer. Disse metoder lider dog alle af de sædvanlige svagheder, der er knyttet til invasive og perturberende metoder. For at overkomme disse problemer har forfatterne udviklet en redox-aktiv variant af Green Fluorescent Protein, GFP.

GFP kan udtrykkes i stort set alle celletyper og compartments og danner autokatalytisk en kraftigt fluorescerende kromofor, som kan visualiseres og kvantificeres fluoremetrisk. Ved at indsætte to cysteiner i en gult fluorescerende variant af GFP har forfatterne skabt et protein kaldet rxYFP, hvis fluorescens egenskaber afhænger af om de to cysteiner findes i deres reducerede thiol form eller i deres oxiderede disulfid form. Når disulfid broen reduceres, stiger proteinets fluorescens til det dobbelte. Årsagen til de spektrale forskelle er undersøgt ved både biofysiske studier og en krystal-struktur af proteinet, og det viser sig at meget små strukturelle forskelle forårsager et skift i protoniseringsgraden af kromoforen og dermed ændring af fluorescensen. In vitro målinger af redoxpotentialet for rxYFP viser at det ligger i et område, der gør rxYFP anvendelig for in vivo målinger. Sådanne målinger er foretaget i cytoplasma af E. coli i både en vild-type stamme og en stamme, hvor genet for Thioredoxin Reductase (trxB) er deleteret. Denne stamme vides at have et mindre reducerende cytoplasma en vild-type E. coli, et resultat der verificeres ved at der observeres mere end 30% mere disulfid form af rxYFP i trxB stammen. I begge stammer er forholdene dog tilstrækkeligt oxiderende til at der kunne dannes svovlbroer og det foreslås at årsagen til at man sjældent finder svovlbroer i cytoplasma ikke primært er det reducerende miljø, men derimod manglen på katalysatorer som Protein Disulfid Isomerase. Med rxYFP har forskere fået et stærkt redskab til at undersøge intracellulære redox forhold, ikke kun i cytoplasma i bakterier, men i mange forskellige celletyper og for eksempel i det endoplasmatiske reticulum og andre compartments med ændrede redox forhold.

Ny splicing inhibitor

The hnRNP A1 protein regulates HIV-1 tat splicing via a novel intron silencer element

EMBO Journal 20 (2001): 5748-5758.
TØ Tange, CK Damgaard, S Guth, J Valcarcel, J Kjems. Aarhus Universitet.

En af de allerstørste landvindinger i biologien har været sekventeringen af det humane og andre genomer. Både  i praksis og i teorien er disse sekvenser af enorm betydning. En af de store overraskelser i forbindelse med offentliggørelsen af det humane genoms sekvens var at antallet af gener var lavere end forventet. Selvom der nok går lang tid inden det endelige tal er kendt, så er der intet der tyder på at vi kommer op i nærheden af de 100.000 gener der en gang var foreslået.

En mekanisme hvormed en celle kan forøge diversiteten af sine aktive proteiner og RNA molekyler udfra et givet antal gener er alternativ splicing. Splicing er processen hvormed der klippes og klistres i primære RNA transkripter og dermed dannes færdige mRNA molekyler. I tilfældet af alternativ splicing kan et transkript kode for en række forskellige proteiner, og dermed kan regulering af splicing benyttes til at regulere protein ekspression og andre cellulære processer. Ligesom regulering af transkription kan splicing reguleres ved hjælp af cis-elementer (her RNA sekvenser) og trans-faktorer (proteiner), og ligesom i transkription observeres der både positiv og negativ regulering. Isolering af de regulerende proteiner og de RNA sekvenser de binder til er vigtig i forståelsen for hvorledes splicing reguleres. I et skridt i denne retning har forskere ved Aarhus Universitet vist at et heterogent nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) er involveret i regulering af splicing.

Ved hjælp af biokemiske og molekylærbiologiske metoder har forskerne vist at et hnRNP kaldet hnRNP A1 kan fungere som en inhibitor af splicing. Når HIV virus skal omsætte sin genomiske sekvens til protein foregår det via alternativ splicing af et langt primært transkript. Derved dannes mere end 30 forskellige mRNA molekyler. Til at regulere disse splicing processer kombinerer HIV egne cis-elementer med den inficerede celles splicing apparat. Splicing af det første tat intron er en velkarakteriseret proces og flere både positivt og negativt regulerende cis-elementer er kendt. Splicing af den andet tat intron er forstået i mindre grad. I et forsøg på at undersøge effekten af et protein ved navn U2AF i denne proces ved at fjerne det kromatografisk, opdagede forskerne at en anden aktivitet forsvandt samtidigt. De viser at denne aktivitet er knyttet til hnRNP A1 og at det virker via et nyt splicing silencing RNA element. Biokemisk evidens tyder på at hnRNP A1 virker ved sterisk at forhindre binding af splicing faktorer til transkriptet. Vi er således endnu et trin nærmere forståelsen af hvordan splicing benyttes til at regulere ekspression af forskellige proteiner.