Proteinstabilitet, vand og solutter

Publiceret Januar 2002

H2O. Ved første øjekast et meget simpelt molekyle. Men på trods af mange års intensive studier af dets egenskaber giver det stadig anledning til hovedbrud. Uden vand, som bekendt intet liv; men hvad er det, der gør vand så specielt? En af de unikke egenskaber ved vandmolekylet er, at det både kan danne og modtage to hydrogenbindinger. Denne egenskab kan virke triviel, men er faktisk årsag til at livet, som vi kender det, eksisterer.

I biologiske systemer opretholdes proteiner og cellemembraner i den aktive konformation gennem vekselvirkning med vand - både struktur og funktion af makromolekylerne afhænger således af, at der er vand tilstede. Biologisk aktivitet er en hårfin balance, der bestemmes af vandets egenskaber - forholdsvis små temperaturændringer vil medføre, at proteiner udfoldes og derved mister deres funktion, og at cellemembraner overgår til en biologisk inaktiv fase. Makromolekylernes stabilitet er afhængig af solventets sammensætning, og derved vandets egenskaber. Stabiliteten kan ændres ved at tilsætte salte eller organisk forbindelser.

Organismer, der kan overleve ekstreme forhold som f.eks. meget lave eller høje temperaturer, producerer visse små organiske forbindelser i høje koncentrationer. Tilstedeværelsen af de organiske forbindelser menes at være en medvirkende årsag til, at disse organismer kan overleve situationer, der for andre levende systemer vil medføre uoprettelige skader. Undersøgelse af hvordan de organiske forbindelser, solutter, påvirker vandet, og dermed makromolekylerne, vil give en generel forståelse for, hvordan man ved tilsætning af solutter til vand vil kunne påvirke stabilitet og opløselighed af makromolekyler. Dette emne er vi en gruppe på Roskilde Universitetscenter der arbejder på at belyse, -hovedsageligt ved anvendelse af termodynamiske målemetoder.

Vand og makromolekyler

Interessen for emnet er opstået ud fra en forundring over, at nogle dyr og planter kan overleve helt ekstreme forhold: det kan være temperaturer langt under frysepunktet eller længere tids tørke. Det har længe været kendt, at disse organismer syntetiserer forskellige organiske forbindelser i høje koncentrationer når de udsættes
for ekstreme påvirkninger. Det drejer sig bl.a. om en række polyoler -heriblandt glycerol, sorbitol og trehalose, og om forskellige frie aminosyrer [1]. Derfor er der naturligt opstået den tanke, at disse forbindelser har en beskyttende effekt på proteiner og cellemembraner, der medvirker til, at de ikke mister deres funktion.

Når vand bindes til overfladen af proteiner opnår proteinerne en øget fleksibilitet, og denne fleksibilitet er afgørende for aktiviteten [2]. Desuden vil den native struktur af et protein opretholdes gennem vekselvirkning med vand. Vandbinding til overfladen af cellemembraner bevirker ligeledes at membranerne fastholdes i en fase, der muliggør, at membranproteinerne kan opretholde deres aktivitet [3]. Hvis vandets egenskaber ændres, kan det betyde, at proteinerne denatureres, eller får mindsket deres aktivitet betydeligt, og at cellemembranerne gennemgår en faseovergang - ændringer der vil være ødelæggende for cellefunktionerne.

"Ændrede egenskaber": her kommer vandets mulighed for at danne hydrogenbindingsnetværk ind i billedet. Normalt beskrives stabiliteten af et foldet protein som en effekt af, at proteinudfoldning vil medføre, at en lang række apolære grupper, der normalt befinder sig i proteinets indre, bliver eksponeret for vandet. De apolære grupper kan ikke indgå i hydrogenbindinger med vand, og vandet kompenserer for de manglende muligheder for vekselvirkninger med grupperne ved at danne indbyrdes hydrogenbindinger. Vandmolekylerne danner således en velordnet struktur omkring de apolære grupper. Dette vil skabe lavere entropi/større orden, og derved en ikke-favorabel situation for systemet. Proteiner vil ved fysiologiske temperaturer være foldet for at undgå de ikke-favorable vekselvirkninger mellem vand og apolære grupper - på den måde opnås den laveste energi.

Når temperaturen øges vil vandmolekylerne ikke i samme grad kunne fastholdes i hydrogenbindingsnetværket omkring de apolære grupper. Derfor vil det, ved en given temperatur, være favorabelt for proteinet at udfoldes. Ved en temperatursænkning vil det være andre ændringer i vandstrukturen der finder sted, men også ved lave temperaturer er konsekvensen, at proteinerne udfoldes [4].

Vandets egenskaber er altså af altafgørende betydning for proteiners stabilitet, og tilsætning af solutter til en opløsning vil, som temperatursvingninger, kunne ændre disse egenskaber. Afhængig af typen af solut, vil det betyde stabilisering eller destabilisering af proteiner. Dette lyder simpelt, men hidtil er der ikke fundet nogen fyldestgørende systematik i hvordan proteiner påvirkes, -man kan ikke umiddelbart afgøre, hvilken effekt en given solut vil have på proteinstabiliteten.

Der er flere indgangsvinkler til denne problematik, der befinder sig indenfor et område som populært kaldes biofysik - hvor bl.a. termodynamik med fordel kan anvendes til beskrivelse af biologiske systemer. Med udgangspunkt i vekselvirkninger mellem proteiner og solutter i vandig opløsning vil jeg i det følgende kort præsentere nogle af de termodynamiske målemetoder, der kan anvendes til at opnå information om systemerne.

Ændringer i proteinopløselighed og stabilitet

Hvordan kan solutter påvirke opløseligheden og stabiliteten af proteiner i vand?

2002_1 liltorp_1.gif
Figur 1.: Cirklen illustrerer et protein. Venstre: solutmolekylerne findes i højere koncentration nær proteinoverfladen end i den øvrige opløsning, medfører proteindestabilisering. Højre: solutmolekylerne findes i lavere koncentration nær proteinoverfladen, medfører proteinstabilisering.

Effekten af solutterne på proteiners stabilitet kan beskrives ud fra koncentrationen af solutten i nærheden af proteinet relativt til i den resterende opløsning. Vandet i en proteinopløsning kan opdeles i to faser: en i den umiddelbare nærhed af proteinet, og en længere væk. Generelt gælder det, at solutter, der er akkumuleret tæt på proteinet vil have en destabiliserende effekt, mens solutter der er delvis ekskluderet fra proteinoverfladen vil have en stabiliserende effekt [5]. De to situationer er illustreret på figur 1. I tilfældet med akkumulering af solutter nær overfladen drejer det sig ikke om decideret binding af solutten til proteinoverfladen - nærmere at solutten "foretrækker" området omkring proteinet frem for vandfasen.

Hvorvidt en solut foretrækker området omkring proteinet afhænger af proteinets affinitet for hhv. vand og solut, og dette afhænger endvidere af vandets affinitet for solutten. Det er således en kompleks balance, der bestemmes af de enkelte komponenters mulighed for at vekselvirke med hinanden.

Akkumulering af solutten nær proteinoverfladen kan opfattes som et udtryk for favorable vekselvirkninger mellem solut og protein. Grunden til
at akkumulering fører til destabilisering er, at udfoldning af proteinet resulterer i, at overfladearealet af proteinet øges betydeligt. Dette medfører øget mulighed for vekselvirkninger med solutten: Favorable vekselvirkninger mellem solut og protein vil generelt medføre en favorisering af den konformation af makromolekylet, med størst overfladeareal. Da akkumulering afspejler favorable vekselvirkninger mellem protein og solut, vil man normalt observere, at proteiners opløselighed øges i en opløsning med solutter, der sænker proteinstabiliteten :

Favorable vekselvirkninger mellem protein og solut:

  • akkumulering af solut nær proteinoverflade
  • øget opløselighed
  • mindsket stabilitet.

Ikke-favorable vekselvirkninger mellem protein og solut:

  • eksklusion af solut nær proteinoverfladen
  • mindsket opløselighed
  • øget stabilitet

I organismer der kan overleve store temperaturudsving, ophobes generelt solutter, der øger proteinstabiliteten, og dette er sandsynligvis medvirkende til, at proteinerne ikke udfoldes under temperaturpåvirkningerne. Udover solutternes indflydelse på opløselighed og stabilitet, vil de påvirke aktiviteten af proteinet. Som regel vil solutter, der stabiliserer proteiner også bevirke en øget enzymaktivitet, og "valget" af stabiliserende solut er derfor ikke ligegyldig, da en ændret enzymaktivitet i levende organismer kan være problematisk [1].

Metoder til bestemmelse af soluttens effekt på proteinstabiliteten

Hvorvidt en solut er akkumuleret eller ekskluderet fra proteinoverflader kan undersøges ved osmometri , hvor man ved bestemmelse af vands dugpunkt kan måle den effektive koncentration af solutter i vand i en opløsning med og uden protein. Hvis den effektive koncentration af solut er højere i proteinopløsningen, vil det være et udtryk for at solutten er ekskluderet fra proteinoverfladen, og derfor sandsynligvis har en stabiliserende effekt på det native protein.

Den generelle effekt af en solut på proteiner kan undersøges ved Differentiel Scannings Kalorimetri (DSC). Her vil udfoldningstemperaturen af et protein kunne bestemmes med og uden solut i opløsningen. En solut der medfører, at udfoldningstemperaturen stiger, vil siges at have en stabiliserende effekt på proteinet. Ved en mere omfattende undersøgelse vil man ud fra DSC målinger kunne bestemme de forskellige termodynamiske størrelser som funktion af temperaturen. Stabiliteten af det native protein beskrives via Gibbs fri energi for udfoldning. En solut der har en stabiliserende effekt på et protein, vil således øge Gibbs fri energi for udfoldning, mens en destabiliserende solut vil sænke Gibbs fri energi. Denne effekt er dog ikke nødvendigvis uafhængig af temperaturen. I nogle tilfælde vil en solut stabilisere proteinet ved høje temperaturer, men have en destabiliserende effekt ved lave temperaturer, og netop DSC målingerne vil kunne beskrive udviklingen. Ikke kun Gibbs fri energi for udfoldning vil kunne bestemmes - også enthalpi og entropiændringer vil kunne følges, og derved bidrage til en forståelse af mekanismerne.

Solut-vand vekselvirkninger

Ud fra de to nævnte metoder kunne man have fået opfattelsen af, at det er solutten og proteinets indbyrdes vekselvirkninger, der afgør om der sker en eksklusion eller en akkumulering af solutten nær proteinet. I virkeligheden findes nøglen til forståelsen af vekselvirkningerne ofte i vandet - det er i højere grad hhv. proteinets og soluttens vekselvirkninger med vand der er afgørende for proteinstabiliteten. Grunden til at en solut "foretrækker" at opholde sig nær proteinoverfladen afspejler en balance mellem protein-vand, solut-vand og solut-protein vekselvirkninger. Lidt firkantet kan man sige, at
ikke-favorable vekselvirkninger mellem vand og solut øger tendensen til at solutten befinder sig nær proteinoverfladen, mens favorable vekselvirkninger mellem vand og solut øger tendensen til eksklusion fra proteinoverfladen. Derfor ligger en del af arbejdet i at forstå solutternes effekt på vand.

For at undersøge en soluts effekt på vandets egenskaber kan man benytte sig af:

Damptryk: Damptrykket over en solutopløsning beskriver hvor "glade" vandmolekylerne er for at opholde sig i vandfasen. Favorable vekselvirkninger med solutten vil komme til udtryk ved en sænkning af damptrykket. Et øget damptryk svarer til at vandet har større tendens til at overgå til gasfasen, og det kan henføres til ikke-favorable vekselvirkninger med solutten.

Overfladespænding: beskriver hvor favorabelt det er for solutten at opholde sig i overfladen frem for i den øvrige opløsning. Solutter der øger overfladespændingen i vandig opløsning vil findes i lavere koncentration nær overfladen, og de samme solutter vil have tendens til at være ekskluderet fra proteinoverflader. Omvendt forholder det sig med solutter, der sænker overfladespændingen.

Isotermisk Titrerings Kalorimetri (ITC): beskriver de energetiske vekselvirkninger mellem vand og solut, og giver herved information om hvordan solutten påvirker det meget specielle hydrogenbindingsnetværk i vand. Sammenholdt med damptryksmålingerne vil ændringer i både enthalpi, entropi og Gibbs fri energi ved tilsætning af solut kunne findes. Derigennem opnås viden om de mekanismer, der enten øger eller mindsker soluttens tendens til at befinde sig nær proteinoverfladen.

Biofysik er et område i hurtig udvikling, og de beskrevne metoder begrænser sig naturligvis ikke til undersøgelse af solut-protein vekselvirkninger. ITC har vist sig at være en meget velegnet metode til studier af bl.a. ligandbinding til proteiner. Desuden kan både kalorimetri og damptryksmålinger anvendes på tørre proteiner og membraner, -eksempelvis ved undersøgelse af vandbinding.

De beskrevne undersøgelser kan bidrage til forståelse af, hvad der gør nogle organiske forbindelser mere velegnede end andre til beskyttelse af cellefunktionerne. Naturligvis kan undersøgelserne ikke opklare de kulde- og tørketolerante organismers "valg" af solutter, da mange andre faktorer også spiller ind, men de kan give en idé om, hvorfor én solut er at foretrække frem for en anden.

Emnet er ikke kun interessant for at forstå overlevelsesmekanismerne hos kulde- og tørketolerante organismer - på sigt vil det være medvirkende til, at man vil blive i stand til at fremstille optimale opløsningsmidler, f.eks. for at øge den termiske stabilitet eller for at ændre opløselighed og aktivitet af et protein.

Referencer:

  1. P. Hochacka & G. Somero: Biochemical Adaptions. Princeton University Press, Princeton, 1984.
  2. P.A. Fields. Comparative Biochemistry and Physiology A - Molecular and Integrative Physiology, 129(2-3): 417-431, 2001
  3. K. Storey & J. Storey. Physiological Reviews, 68, 27-84, 1988
  4. G. Graziano, F. Catanzano, A. Riccio, G. Barone. Journal of Biochemistry, 122(2), 395-401, 1997
  5. S. Timasheff. Advances in Protein Chemistry, 51, 355-432, 1998