Fra 3-mer DNA til Microarray Biochips

Publiceret Oktober 2000

Historien om syntetisk DNA i Danmark 

Hvem kender i dag  ikke ordet DNA? Men man skal ikke mange år tilbage før ordet DNA kun var kendt af fagfolk, og begrebet eksisterede ikke blot vi går 40 år tilbage i tiden. Watson og Crick (1) var i 1953 de første der beskrevDNA og dens dobbeltstreng. I 1960'erne var Khorana og medarbejdere (2) de første til syntetisk at fremstille en kort streng DNA.

Det åbnede en helt ny verden. I Danmark interesserede institutleder Kaj Brunfeldt fra Protein Kemisk Laboratorium i Forskningscentret ved Hørsholm sig  ret tidligt for DNA synteserne. Kaj Brunfeldt havde to medarbejdere civ. ing. Keld Norris og civ.ing. Thorkild Christensen, som begge i henholdsvis 1978 og 1981 blev sendt til USA for at lære at synthetisere stykker af DNA. Keld Norris var hos Prof. Khorana (3). Det lykkedes dem begge i løbet af 1/2 år at fremstille et stykke DNA, der var 3 -10 baser lange. På det tidspunkt fandtes der ingen maskiner som kunne syntetisere DNA og alt blev fremstillet i kolber med håndkraft.

På samme tidspunkt drev civ.ing. Niels Clauson-Kaas sit private forskningslaboratorium i Farum med 10 kemikere. Niels Clauson-Kaas var kendt for i en menneskealder at være en af de førende kemikere i Danmark og Kaj Brunfeldt foreslog omkring 1980 at Niels Clauson-Kaas skulle begynde fremstillingen af de specielle byggestene som DNA består af: deoxyAdenosin (dA), deoxyCytidin (dC), deoxyGuanosin (dG) og Tymidin (T), tilsammen i korthed deoxynucleic acid (DNA).

Niels Clauson-Kaas kom aldrig i gang med dette projekt, da det blev overhalet af de hurtige amerikanere. 1981 og 1983 blev mærkeår, da Caruthers og medarbejdere (4) publiserede metoder til fremstilling af DNA stykker. Deres metode bestod i at byggestenene blev omdannet til derivater, der var stabile og kunne anvendes til automatiserede fremstillinger af kunstig DNA. Keld Norris var på hjemlig front med i dette stykke pionerarbejde og var en af de første i verden der anvendte fastfasesyntese af DNA.

I begyndelsen af 1980'erne fandt prof. Herbert Köster på en modificeret udgave af DNA syntesen (5), som bestod i at gøre byggestenene, de såkaldte phosphoramiditter, mere stabile og reaktionsdygtige, og denne metode anvendes iøvrigt stadig. Applied Biosystem Inc. (ABI) købte licenserne til fremstilling af kemikalierne, som skulle bruges til synteserne, samtidig med at den første kommercielle automatiske DNA syntesemaskine (ABI 380, eenstrenget maskine) blev lanceret i 1985. Mens ABI startede fremstilling af phosphoramiditter i Californien startede prof. Köster sin fabrik i Hamburg (Biosyntech). Begge firmaer fremstillede alle de kemikalier og reagenser som skulle bruges til DNA syntesen. Prof. Köster gik senere i samarbejde med Milligen og Biosearch, som i midten af 1980¹erne lancerede deres versioner af DNA syntesemaskiner: Biosearch 8700 og lidt senere deres Expedite.

Lektor Otto Dahl på Kemisk Laboratorium 2, KU, havde i flere år arbejdet med phosphorkemi, og det var naturligt for ham at gå i gang med DNA syntesen, da kemien i fremstilling af DNA i høj grad er baseret på phosphorkemi. Otto Dahl fik i 1984 bevilliget sin første DNA syntesemaskine af mærket Nucsyn. Den blev dog hurtigt efterfulgt af en ny og større model af typen Biosearch 8700, en yderst pålidelig firestrengs maskine, som stadig er i daglig anvendelse på Kemisk Laboratorium 2.  Keld Norris var i mellemtiden flyttet til Novo A/S, Bagsværd, og fik sin første ABI 380 maskine i 1985, og Thorkild Christensen var flyttet til Nordisk Gentofte A/S, Gentofte. Begge virksomheder ønskede på det tidspunkt at kunne fremstille humant Insulin ved hjælp af gensplejsning og dertil skulle man anvende den nye teknologi med fremstilling af kunstigt DNA populært kaldet en oligo, som dækker betegnelserne for primere og prober.

Afsættet

Nu tog tingene fart. Carlsberg Forskningscenter fik i 1985 sin egen maskine. De ville forske i gærs genom. Desuden blev der i hurtig rækkefølge installeret DNA syntese maskiner af mærket ABI hos Københavns Universitets afdeling på Ø. Farimagsgade, Institut for Medicinsk Biokemi og Genetic, Institut for Populationsbiologi, Patologisk-Anatomisk Institut, Århus Universitet, Bioteknologisk Institut (Milligen Instrument), Lyngby, Landbohøjskolen (Milligen Instrument), Frb., Institut for Mikrobiologi, DTU, Lyngby, Rigshospitalet, Kbh., Kræftens Bekæmpelse, Kbh., Dako, Glostrup, Danisco, Kbh., Statens Serum Institut, Kbh., Odense Universitet (Pharmacia instrument). Flere afdelinger på det senere Novo Nordisk A/S, Bagsværd, anskaffede sig selvfølgelig også DNA syntesemaskiner.

Maskinerne udviklede sig fra midten af 1980'erne til 1991, hvor den populære ABI 394 blev introduceret. Det var en 4 strengs maskine, der på det tidspunkt dækkede alles behov for oligoer. Den kunne lave små mængder (40 nmol skala) op til større mængder (10 mikromol skala). Den var fuldt automatiseret, idet man fra sin Mac computer kunne sende de ønskede sekvenser over, vælge skala, osv., trykke på startknappen og efter 2-3 timer var 4 oligoer af almindelig længde syntetiserede. Man kunne rutinemæssigt fremstille op til 12 oligoer om dagen.

2000_4 dna_synt.jpg
DNA syntesemaskiner i et moderne DNA synteselaboratorium.

Kemien

Opbygningen af DNA-molekylet foretages på DNA syntesemaskinen i en lille kolonne. Kolonnen er fyldt med passende mængde af det første nukleosid bundet til en fastfase, som kan være en polystyren overflade eller såkaldt CPG (controlled pore glass). På maskinen tilsluttes i opløsning de fire byggestene (phospho-ramiditter), også kaldet henholdsvis dA amidit, dC amidit, dG amidit og T amidit, samt de 5 hjælpereagenser: Tetrazolopløsning, Cap A og Cap B opløsninger, iodopløsning, trikloreddike-syreopløsning samt acetonitril, som anvendes som skyllemiddel. Inde i maskinen findes en serie ventiler, som styres af en computer. Man indkoder den ønskede sekvens i computeren eller, som nu om dage, man sender sekvensen direkte over fra en database, påsætter kolonnen med den rigtige startnukleosid og trykker på startknappen. Via et indbygget program styres åbning og lukning af ventilerne således at reagenser og solventer bliver ledt gennem kollonnen i den ønskede rækkefølge.

Opbygningen af et DNA-molekyle med de beskrevne reagenser foregår som vist på fig. 1. Koblingen mellem det første nukleosid siddende på fastfasen og det næste i rækken katalyseres af tetrazol. Der dannes en phosphit-bro i stedet for den ønskede phosphat-bro, så en oxidation er nødvendig, hvilket sker med iod/vand. Da reaktionen ?kun? går i omkring 99% udbytte skal den sidste ene procent gøres inaktiv med capping reagenserne (en acetylering af ureageret OH-gruppe). Efter capping og oxidation fraspaltes beskyttelsesgruppen DMT (dimethoxytrityl-gruppen) ved hjælp af trikloreddikesyre opløst i diklormetan og derved frigøres en fri OH gruppe, og det hele starter forfra med kobling til det tredie nukleosid i rækken. Rækken af syntesentrin udgør sammen med vasketrin en reaktionscyclus og forløber i et samlet udbytte på 98-99%, hvilket stiller høje krav til renhed af kemikalier og reagenser. Syntesen starter altid fra 3¹-enden.

KJ Ross-Petersen AS

Omkring 1990 var problemet for mange molekylær biologer at prisen for primere og prober  på gr. af kemikaliepriserne var skyhøj. Prisen på de fire byggestene samt de 5 hjælpereagenser var så høj at een kobling kostede ca. 20 kr. i rene kemikalieomkostninger. Phosphoramiditerne kostede da prisen var højest ca. 1.800 kr. per gram. I dag er prisen under en tiende del.

Undertegnede havde siden marts1984 drevet firmaet KJ Ross-Petersen AS som selvstændig forskningslaboratorium i Forskningscentret ved Hørsholm og havde i 1988 behov for en mindre produktion af mere kostbare stoffer. Otto Dahl gav mig ideen til at fremstille phospho-ramiditterne i mit laboratorium og efter 1 års forskning i laboratoriet og med stor støtte fra Otto Dahl blev de første gram syntetiseret i Hørsholm samtidig med at de første flasker af hjælpekemikalerne blev fremstillet. Det hele blev påfyldt og solgt med egne etiketter og i flasker som direkte kunne påsættes de forskellige DNA syntesemaskiner.

Carlsbergs Forskningslaboratorium var undertegnedes første kunde, men kort tid efter kom stort set alle andre danske brugere i kundekartoteket. To ting gjorde udfaldet: Kvaliteten af kemikalierne var i top og prisen blev sat som i USA og England, hvor priserne var ca. det halve af hvad den danske ABI agent forlangte. Den lave pris var især attraktivt for universiteterne med deres altid begrænsede budgetter.

Custom DNA syntesis

Da Otto Dahl var den første som i offentligt regi fremstillede oligoer i forbindelse med sin forskning kom flere og flere til ham for at få ham til at levere en oligo eller to og dermed opstod i virkeligheden i Danmark det første custom DNA synteselaboratorium. Det skal dog nævnes at det ikke blev drevet kommercielt. Otto Dahl solgte ikke oligoerne, men fremstillede dem som en service. På samme måde opererede Århus Universitet  omkring 1990, da de fik bevilliget deres maskine. Bioteknologisk Institut i Lyngby med læge Claus Christiansen som institutleder (senere Danisco) fik i 1988 startet forretningsområdet ³salg af oligoer². De havde anskaffet sig en 2 strengs Milligen maskine og ved siden af deres eget forbrug af oligoer solgte de custom made oligoer for 35 kr. per base. Læge Poul Andersson var ansvarlig for produktionen, og han blev hurtigt klar over, at for at det skulle blive et rentabelt forretningområde skulle Bioteknologisk Institut fremstille over 2000 oligoer per år. Det kunne de ikke med den daværende instrumentering og de stoppede derfor egenproduktionen.

I 1993 etablerede cand. scient. Sten Lovmand og undertegnede Danmarks første rene Custom DNA synteselaboratorium DNA Technology A/S. Sten Lovmand stod på det tidspunkt for produktionen af oligoer på Århus Universitet og havde lyst til at være selvstændig. Han foreslog et samarbejde med undertegnede, som havde alle kemikalierne, og vi lejede lokaler i Forskerparken i Århus, og med Århus Universitet som første kunde var virksomheden i gang. Undertegnede fik hurtigt flere af sine kunder i Københavnsområdet til enten at skifte fra en udenlands leverandør eller fra en urentabel egenproduktion til at købe oligoer i Århus. Priserne per base var ca. 12 kr og opefter. Men efter en succesrig periode opstod diskussionen om de fremtidige forretningsområder og efter 3 års samarbejde forlod undertegnede virksomheden i foråret 1996.

Masseproduktion af DNA

I 1996 startede cand. polit. Jakob Ross-Petersen virksomheden TAG Copenhagen. Filosofien bag TAG Copenhagen var at markedet ville fortsætte med at vokse eksplosivt og at der derfor var behov for etablering af en produktion baseret på helt nye principper og rutiner. Virksomheden blev organiseret således at den kunne håndtere et produktionsniveau der var op til 10 gange så stort som det komplette danske marked i 1996.

Det har siden vist sig at være en rigtig strategi. TAG Copenhagen er idag nået op på et produktions niveau langt over det samlede oligo marked i 1996 og priserne er med den nye produktionsteknologi og den nye organisering kommet helt ned i 3 kr. per base.

TAG Copenhagens succes har givet genlyd ude i verden og virksomheden har nu eksporteret sit koncept til flere DNA synteselaboratorier i lande uden for Skandinavien.

Microarray biochip teknologien I disse år forskes der overalt på fremstilling af Microarray biochips, hvor tusinder af oligoer eller DNA fragmenter fremstillet ved hjælp af PCR teknik, bliver sat på en glas- eller plastoverflade. Der kan typisk påsættes 5 - 10.000 forskellige DNA stykker på et areal mindre end 1 cm2. Chipsenes fremtid ligger i at de kan anvendes til bl.a. screening af blod, hvor man søger efter bestemte gener. Der ligger store udfordringer for oligohusene, når de pludselig skal fremstille f. eks. 5000 forskellige oligoer til påhæftning på chips. Her forventes især TAG Copenhagen at komme med i front på grund af sin avancerede fremstillingsteknologi til masseproduktion af DNA.

Referencer:

  1. J.D. Watson og  F.H.C. Crick, Nature 171 (1953) 737.
  2. H.G. Khorana, Pure Appl. Chem. 17 (1968) 349.
  3. K. Norris, Dansk Kemi 53 (1972) 107, K. Brunfeldt, Dansk Kemi 65 (1984) 324.
  4. S.L. Beaucage og M.H. Caruthers, Tetr. Lett. 24 (1983) 245, L.J. Mc.Bride og M.H. Caruthers, Tetr. Lett. 24 (1983) 245.
  5. H. Köster and N. Sinha, Biosyntech, Hamburg, Eur. 0152 459.