Hans H. Ussing

Publiceret April 2000

Hans H. Ussing blev født 1911 i Sorø. Han blev kandidat i biologi i 1934, dr. phil 1938, professor i zoofysiologi 1950 og professor i biokemi i 1960, selvom hans egentlige forskningsfelt bedst kan betegnes som biofysik. Siden 1946 har hans studier været koncentreret om sammenhængen mellem biologisk salt og vandtransport og bioelektriske fænomener.

Hans H. Ussing tegnet af Hans Bendix i Politiken i maj 1964
Hans H. Ussing tegnet af Hans Bendix i Politiken i maj 1964 i forbindelse med at Ussing, sammen med professor Lundsgaard, fik den fornemme norske Anders Jahre-pris.

Egentlig var det først marinbiologien, der havde Ussings hjerte. Som student deltog han i Lauge Koch ekspeditionen til Østgrønland i 1933, og hans disputats (1938) kom til at omhandle planktonorganismer i østgrønlandske fjorde. Allerede da blev Ussing imidlertid distraheret. Larvestadiet hos mange copepoder er ikke til at skelne fra hinanden og Ussing fik den ide at lave antistoffer mod de enkelte larver og så fælde dem een ad gangen. Han henvendte sig til August Krogh, som imidlertid var dybt optaget af noget helt andet, nemlig anvendelse af tungt vand, som lige var blevet tilgængeligt. Han tilbød den begavede, unge forsker istedet at arbejde med brugen af tungt vand i studiet af vand permeabiliteten i cellemembraner.

Ussing beskriver selv denne første tid i August Krogh’s laboratorium som et fascinerende, internationalt miljø, Stemningen fik de unge forskere til at tro på at intet problem var for svært, hvis man nærmede sig det med klare analyser og en masse "common sense"(Ussing, 1980). Ussing beskriver også, hvordan håndværket med det at udvikle og skabe apparatur, der var nødvendigt for undersøgelserne, var en central del af laboratoriets arbejde. Laboratoriet levede i høj grad af de apparater, de udviklede og solgte til hospitaler og forskningsinstitutioner.

I nogle år var Ussing dybt optaget af brugen af deuterium i en hel anden sammenhæng end osmoregulering, nemlig i proteinkemien. Han viste her, at man ved at fodre rotter med tungt vand kunne få mærket rottens proteiner med tung brint. Han var således en af de første,der kunne vise, at organismens proteiner til stadighed nedbrydes og opbygges. Noget som i dag er en selvfølge, men som dengang var en revolutionerende tanke. De vigtigste kontakter i de år var Linderstrøm-Lang på Carlsberg Laboratoriet og Brøndsted, professor i Fysisk Kemi ved Københavns Universitet.

I 1946 holdt August Krogh sit berømte "Croonian Lecture", hvor han for første gang introducerede begreberne aktiv transport (pumpning) af ioner og passiv læk af ioner. Ionerne pumpes den ene vej under brug af metabolisk energi og lækker passivt den anden vej. Grunden til at man kunne måle denne transport var brugen af radioaktive isotoper, der kan tilsættes specifikt på den ene side af membranen. Dette blev starten til et større projekt under Ussings ledelse. Krogh, Hevesy og Niels Bohr havde søgt og fået en cyklotron til Niels Bohr Instituttet. Det var den første i Europa og den muliggjorde, at fysiologerne i København kunne få de nødvendige isotoper til projektet. Team’et var Ussing, Hilde Levi og Barker Jørgensen, isotoperne var 38Cl og 24Na og forsøgsorganismerne var axolotler og isoleret frømuskel, samt ikke så længe efter - det isolerede frøskind, der skulle blive studieobjektet gennem mange, mange år. Fra arbejdet med frømusklen kom den første beskrivelse af 1:1 exchange diffusion, der blev introduceret til at forklare den hurtige udveksling af Na+ i frø musklen, hvor Na+ fluxen ud af muskelfiberen var alt for hurtig til at kunne være aktiv transport (Ussing 1947). Exchange diffusion er siden fundet at være af meget stor fysiologisk betydning f.eks. i det røde blodlegeme hvor et membranprotein udveksler Cl- med HCO3- . Grunden til at exchange diffusion er så biologisk vigtig er, at den tillader udveksling af ladede stoffer gennem elektrisk tætte cellemembraner.

Hans H. Ussing i 1955
Hans H. Ussing i 1955, midt i den
nok allermest kreative periode i
forskerkarrieren.
Ussing-kammerteknikken var
introduceret, det samme var Flux ratio
ligningen og To-membranhypotesen
var ved at blive udarbejdet. Foto
velvilligt udlånt af Videnskabernes
Selskab (Foto: Elfelt )

Flux ratio ligningen

For at komme videre i studiet af aktiv og passiv iontranport var det nødvendigt med en matematisk model, der kunne beskrive elektrodiffusion over en biologisk membran eller over et epitel. Det var vanskeligt fordi man var nødt til at antage enten en lineær koncentrationsgradient over epitelet, hvilket ikke var særlig sandsynligt, eller et konstant elektrisk felt over epitelet, hvilket måske heller ikke var sandsynligt. Ussings specielle intuition kom ham her til hjælp, og han fik den ide, ikke at se på de enkelte fluxe, men kun på forholdet mellem fluxen ind og fluxen ud. Denne ratio kunne han vise var en tilstandsfunktion, der ikke er afhængig af den barriere, som ionen passerer, men kun af den elektriske potentialdifferens og forholdet mellem koncentrationerne på de to sider. Han gik straks i gang med at anvende teorien og publicerede resultaterne i sin siden så berømte flux ratio artikel (Ussing, 1949). Han og Hilde Levi viste herefter, at iodid gav en flux ratio, der passede med, at iodid blev transporteret passivt, mens Na+ udviste en langt højere flux ratio og altså blev transporteret aktivt (Levi og Ussing, 1949). Man havde i brugen af isotoper og flux ratio ligningen fået et genialt instrument til at skeldne passiv elektrodiffusion fra andre former for transport.

Oprindelig var flux ratio ligningen kun udledt for steady-state fluxe. Ussing var imidlertid overbevist om dens gyldighed også i en lang række non-steady-state situationer. Det matematiske bevis for, at han havde ret, blev publiceret omend langt senere i 1981. Dette har yderligere udvidet nytten af flux ratio-ligningen meget.

Kortslutningsopstillingen, Ussingkammeret

Når man spænder et frøskind op imellem to identiske saltopløsninger, så bliver indersiden af skindet eller den side, der har vendt ind mod blodet positiv (100 millivolt). Ussings hypotese var, at aktiv pumpning af Na+ ioner over frøskindet skabte dette potentiale, og at Cl- ionerne fulgte passivt med. Problemet var imidlertid at påvise det med sikkerhed. Ussings idé var simpel og genial, han ville kortslutte frøskinnet, eller sagt på en anden måde, han ville sætte det elektriske potentiale over frøskinnet til 0. Såfremt koncentrationen af en ion er ens på begge sider af epithelet, og den elektriske potentialdifferens er nul, er der ingen kraft, der kan give nettotransport af ionen, og den vil udvise en fluxratio på én. Hvis en ion transporteres aktivt, må den udvise en flux ratio, der er højere. Ussing kontaktede kemikeren K. Zerahn og sammen konstruerede de det senere så berømte Ussing kammer og lavede de første kortslutningsforsøg (Ussing og Zerahn,1951). Disse viste ganske rigtigt, at kun Na+ blev transporteret aktivt - Cl- fulgte passivt med, og at kortslutningsstrømmen var lig med Na+ transporten. Samtidig gik iltforbruget op i kammeret, hvilket viste, at der blev brugt energi til Na+ transporten. Endelig viste forsøgene, at hvis dannelsen af ATP blev blokeret med dinitrofenol, gik Na-pumpen gik i stå, hvilket indikerede, at der på en eller anden måde måtte bruges ATP til den aktive transport.

Denne kortslutningsopstilling (Ussingammerteknikken) blev et gennembrud i studiet af membrantransport. Efter at Ussing havde forelagt resultaterne ved en kongres i København i 1950, blev hans laboratorium i en lang række år et mekka for udenlandske forskere, der ville studere transport over membraner under Ussings vejledning. Kombineret med isotopteknik med forskellige isotoper på de to sider og måling af flux ratioen gav det muligheder for at studere steady-state transporvejene på en måde, der ellers aldrig ville have været mulig. Kortslutningsteknikken anvendes stadigvæk i hundreder af laboratorier verden over ved studiet af iontransport over epitheler.

Det blev frugtbare år i København med konstant flere gæster i laboratoriet end antallet af ansatte. Blandt de vigtigste kan nævnes Adrian Hogben, Alex Leaf, Peter Curran, Dan Tosteson og Gerhard Giebisch. Først løste man problemet med „solvent drag" dvs. det problem, der opstår med flux ratio-ligningen og kortslutningsteknikken, hvis man har et væskeflow gennem systemet. Allerede på dette tidspunkt indså Ussing, at interaktionen mellem vand og transporterede ioner kunne have væsentlige konsekvenser. Derfor videreudviklede han flux ratio ligningen, så den også omfattede situationer med vædskestrømning gennem vandfyldte kanaler („solvent drag"). Løsningen på dette blev publiceret i 1952 (Ussing 1952). Dernæst fulgte en række vigtige gennembrudsarbejder. Det viste sig, at i andre væv var det Cl- ionen, der gav strømmen over epitelet og byggede potentialet op, hvilket også gjalt i kirtlerne i frøskindet, når disse blev stimuleret med adrenalin. Det blev også vist, at Na+ var helt essentiel for optagelse af 3-methylglucose, hvilket senere viste sig at være cotransport.

To-membranhypotesen

Det var selvfølgelig i det lange løb utilfredsstillende at studere et Na+-transporterende epitel som en black box, og man begyndte at beskæftige sig med organiseringen af epithelet. Ideerne tager udgangspunkt i et elektrisk ækvivalenskredsløb for et epithel, hvor man klart ser, at der er tre komponenter: En udadvendt membran, en indadvendt membran og en „shunt". En række meget elegante forsøg førte så i 1958 til to-membranhypotesen, hvor den indadvendte membran blev postuleret at besidde Na+-pumpen samt passive lækveje for K+ og Cl-, men mangle passiv Na+ permeabilitet. Den udadvendte membran derimod var passivt gennemtrængelig for Na+ og for Cl-, men var tæt for K+ og havde ingen pumper (Kofoed Johnsen og Ussing,1958). I princippet holder alle disse antagelser stadig for Na+ transporterende epiteler, og selv i dag starter overraskende mange artikler med ordene: "Acording to the two-membrane hypothesis....".

2000_2 ussing_3b.jpg
Kortslutningsforsøg med et frøskind anbragt i et Ussing kammer. Hans H Ussing og hans laborant gennem mange år Birgit Hasman.

Volumenregulering

Pumpe-læk steady-state concepted var godt nok introduceret af Krogh i 1946, som nævnt ovenfor, men det blev udviklet i detailler af Alex Leaf og Ussing. Denne beskrivelse står sammen med en næsten samtidig beskrivelse af Tosteson og Hoffman den dag i dag. Siden har Ussing også bidraget til studiet af de dynamiske og kontrollerede ændringer, der sker i de forskellige læk transportveje som kompenserende svar på volumenændringer. En meget vigtig metode til at studere volumen i epiteler blev introduceret i 1961. Opstillingen var designet således, at volumet af epitelet (højden) kunne følges i mikroskopet samtidig med, at det transepiteliale potentiale eller kortslutningsstrøm kunne måles. Det blev de første studier af volumenkontrol i epiteler, et felt der siden er taget op af adskillige grupper med metoder, der i princippet bygger på samme ide. Faktisk blev forsøgene startet for at teste konsekvenserne af to-membranhypotesen. Et meget vigtigt trin i denne retning kom med Ussing og Windhagers model af epitelet som et flerlaget funktionelt tredimensionalt syncytium med samlede egenskaber som forudsat i to-membranhypotesen. Epitelets celler er ifølge den teori koblet via intercellulære ionpermeable porer. Det betyder, at det er meningsfuldt at korrelere volumenændringer af hele epitelet med cellulære transportparametre. Denne kobling mellem cellerne var en vigtig antagelse, der senere har haft stor betydning især ved studiet af lække epiteler. Med hensyn til volumenregulering i epitelcellen, genoptog Ussing emnet i 1980’erne og lavede en lang række vigtige bidrag til belysning af dette (Ussing 1986). I disse år fik jeg selv lejlighed til at føre spændende samtaler og diskussioner med Ussing.

I slutningen af 1980erne påbegyndte Ussing sine studier af den isotone vandtransport (Ussing og Eskesen,1989). Dette emne har optaget tankerne og ideerne siden. Den enkle geniale idé om, at det er den regulerede "recycling" af den aktivt pumpede ion (Na ionen), der styrer toniciteten af den transporterede vædske er nu ved at blive teoretisk færdigbearbejdet i samarbejde med Erik Hviid Larsen på August Krogh Instituttet.

Klare analyser og en masse "common sense", så er der ikke noget problem, der ikke kan løses, var den lære, som den unge Ussing fik, og Ussing blev en forsker med så sikker en sans for de enkleste løsninger på problemerne, at naturen simpelthen bør have valgt dem. Tit er Ussing's teorier blevet mødt med skepsis umiddelbart efter, at de blev publiceret. Siden har det vist sig, at han fik ret.

Referencer:

  • Ussing, H.H. (1938). The biology of some important plankton animals in the fjords of east Greenland. Disputats, Københavns Universitet.
  • Ussing, H.H. (1947). Interpretation of the exchange of radiosodium in isolated muscle. Nature 160: 262-263.
  • Ussing, H.H. (1949 ). The distinction by means of tracers betwen active transport and diffusion. Acta. Physiol. Scand.18:43-56.
  • Levi, H., and Ussing, H.H. (1949). Resting potential and ion movements in the frog skin. Nature. 164: 928-930.
  • Ussing, H.H. og Zerahn, K.(1951). Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiol. Scand.23: 110-127.
  • Ussing, H.H. (1952). Some aspects of the application of tracers in permeability studies. Adv. Enzymol. 13: 21-65.
  • Kofoed-Johnsen,V. and Ussing, H.H.(1958), The nature of the frog skin potential. Acta. Physiol.Scand. 42:298- 308
  • Ussing, H.H. (1980). Life with tracers. Ann. Rev. Physiol. 42: 1-16.*
  • Ussing, H.H. (1986). Epithelial cell volume regulation illustrated by experiments on forg skin. Renal Physiol 9:38-46
  • Ussing, H.H. and Eskesen, K. (1989). Mechanism of isotonic water transport in glands. Acta. Physiol.Scand. 136:443-454.

* Denne artikel indeholder Ussings egen beskrivelse af de mange år med isotoparbejdet og har været en vigtig kilde til nærværende artikel.